研究背景:缩宫素（Oxytocin,OT）是经典的神经垂体激素,由下丘脑合成,沿轴突转运到垂体后叶释放,其生理作用是促进子宫平滑肌收缩和射乳。研究表明,肠神经系统（Enteric nervous system,ENS）能够合成和分泌OT。我们实验室前期研究也证明OT是一种胃肠神经肽,调节胃肠道的运动。巨噬细胞是肠道免疫稳态的主要参与者,在不同的肠道微环境下可以极化为促炎型巨噬细胞和抗炎型巨噬细胞。肌层巨噬细胞（Muscularismacrophages,MMs）靠近肌间神经丛,与肠神经元相互作用共同调节肠道运动,维持肠道免疫平衡。ENS和MMs之间存在着直接的对话,我们实验室前期研究也发现OT通过影响巨噬细胞的极化来缓解结肠炎,但是巨噬细胞极化是否会影响OT及其受体（OT receptor,OTR）的表达尚不清楚。在本课题中我们首次揭示了巨噬细胞极化影响肠神经元中OT和OTR的表达及其机制,提示OT可能是MMs和ENS对话的重要分子,为治疗免疫系统异常导致的胃肠道疾病提供新思路。研究方法:1.小鼠结肠肌间神经元的分离培养选取6-8周龄雄性健康小鼠,剪取约3-5 cm长的近端结肠,剪去肠系膜及周围组织,并沿着肠系膜纵向剖开肠段。将组织平铺在盛有柯氏液的硅胶盘中,彻底清洗内容物,解剖镜下使用显微器械依次撕去黏膜层、黏膜下层、环形肌层和浆膜层,制备纵行肌-肌间神经丛（Longitudinal muscle myenteric plexus,LMMP）标本。立刻将标本放于含10mg/ml木瓜蛋白酶的柯氏液中37℃水浴消化50分钟,再将标本小心剪碎后立刻放入含1 mg/ml胶原酶Ⅱ的基础培养基中37℃消化55分钟,每隔15分钟吹打30余次,终止消化后,1000 rpm离心6分钟,弃去上清,用含有10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的基础培养基将沉淀重悬,放入含有5%CO2,37℃的恒温培养箱中培养。细胞培养4小时后,更换培养基,显微镜下观察肠神经元的形态及活性。2.实验性结肠炎小鼠模型制备选取6-8周龄雄性健康小鼠,采用饮用水中加入2.5%葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium,DSS）7天的方法制作急性结肠炎模型。从第2周起,小鼠恢复标准饮用水。在第7、14、21、28和49天牺牲小鼠。通过记录各组小鼠体重、结肠长度、疾病活动指数（Diseaseactivity index,DAI）、黏膜通透性、结肠组织石蜡切片的H＆E染色和组织学评分等方法评估DSS诱导的小鼠急性结肠炎炎症程度。3.利用免疫荧光技术检测OT在分离培养的肠神经元上的表达、小鼠结肠F4-80/iNOS双阳性细胞的表达、小鼠结肠Iba1/Arg1双阳性细胞和整个LMMP中CD206阳性细胞的表达。4.利用实时荧光定量PCR技术检测分离培养的肠神经元以及结肠LMMP中OT信号系统相关分子、巨噬细胞标志物、炎症因子的基因表达情况。5.利用ELISA检测细胞培养液上清中OT和炎症因子的浓度变化。6.利用western blot检测分离培养的肠神经元以及结肠LMMP中OT、OTR、PEG3、STAT3、NF-κB、SMAD2/3 蛋白的表达。研究结果:1.M1型和M2型巨噬细胞上清液对肠神经元OT和OTR表达的影响首先用LPS诱导巨噬细胞系Raw264.7向M1方向极化,用IL-4诱导其向M2方向极化,然后分别用两种类型的巨噬细胞上清液孵育肠神经元。与对照组相比,M1型巨噬细胞上清液降低肠神经元中OT和OTR的mRNA和蛋白表达,而M2型巨噬细胞上清液则上调其表达。M0型巨噬细胞（未经药物刺激）上清液对其无影响。以上结果说明M1型巨噬细胞抑制肠神经元OT和OTR的表达,M2型巨噬细胞促进肠神经元OT和OTR的表达。分别将肠神经元在含LPS或IL-4的培养液中培养24小时,OT和OTR的表达均无明显变化,说明LPS和IL-4本身不影响肠神经元中OT和OTR的表达。2.M1型巨噬细胞释放的促炎因子对肠神经元OT和OTR表达的影响首先检测M1型巨噬细胞上清液中几种促炎因子的浓度,发现TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度较对照组明显升高。再分别使用不同浓度的TNF-α,IL-6和IL-1β孵育肠神经元,三种促炎因子均明显抑制肠神经元中OT和OTR的mRNA表达。如果事先采用以上三种细胞因子的受体拮抗剂（Tocilizumab,IL-6受体拮抗剂;R-7050,TNF-α受体拮抗剂或IL-1RA,IL-1受体拮抗剂）孵育能够逆转TNF-α、IL-6和IL-1β对OT和OTR mRNA表达的抑制作用。三种细胞因子的受体拮抗剂协同孵育也能逆转M1型巨噬细胞上清液对OT mRNA表达的抑制作用。以上结果说明M1型巨噬细胞可能通过释放促炎因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）抑制肠神经元OT和OTR的表达。3.M2型巨噬细胞释放的抗炎因子TGF-β对肠神经元OT和OTR表达的影响首先检测M2型巨噬细胞上清液中TGF-β的浓度,发现TGF-β的浓度较对照组明显升高。使用TGF-β孵育明显升高肠神经元中OT和OTR的mRNA水平。如果事先采用TGF-β的受体拮抗剂LY2109761孵育将逆转TGF-β和M2型巨噬细胞上清液对OT和OTR的mRNA表达的促进作用。以上结果说明M2型巨噬细胞可能通过释放TGF-β促进肠神经元OT和OTR的表达。4.三种促炎因子抑制肠神经元OT和OTR表达的信号通路IL-6或TNF-α孵育明显升高肠神经元中STAT3蛋白的磷酸化水平,如果事先采用Stattic孵育抑制STAT3蛋白的磷酸化水平,IL-6或TNF-α不再影响肠神经元中OT和OTR的表达。以上结果表明IL-6和TNF-α通过激活STAT3信号通路抑制肠神经元中OT和OTR的表达。IL-1β孵育不影响肠神经元中STAT3蛋白的磷酸化水平,但是明显上调肠神经元中NF-κB蛋白的磷酸化水平,如果事先采用Bay11-7082孵育抑制NF-κB蛋白的磷酸化水平,也能逆转IL-1β对OT和OTR表达的抑制作用。以上结果表明IL-1β通过激活NF-κB信号通路抑制肠神经元中OT和OTR的表达。5.TGF-β促进肠神经元OT和OTR表达的信号通路TGF-β孵育显著上调肠神经元中SMAD2/3蛋白的磷酸化水平,如果事先采用SIS3 HCl孵育抑制SMAD2/3蛋白的磷酸化水平,TGF-β孵育不再影响肠神经元OT和OTR的蛋白表达。以上结果表明TGF-β通过激活SMAD2/3信号通路促进肠神经元中OT和OTR的表达。6.PEG3在M2型巨噬细胞促进肠神经元OT和OTR表达中的作用已有研究表明父性表达基因3（Paternally expressed gene 3,PEG3）调控OT和OTR的表达,但巨噬细胞释放的促炎和抑炎因子是否通过该基因调节OT和OTR的表达尚不清楚。本实验发现M0型巨噬细胞上清液、M1型巨噬细胞上清液和促炎因子（IL-6、TNF-α和IL-1β）孵育不影响肠神经元中PEG3的mRNA表达,但是M2型巨噬细胞上清液和TGF-β孵育则下调其表达。Western blot结果显示,TGF-β孵育明显下调肠神经元中PEG3的蛋白水平,如果事先采用SIS3 HCl孵育抑制SMAD2/3信号通路,TGF-β不再影响PEG3、OT和OTR的蛋白水平。综上所述,M2型巨噬细胞通过释放TGF-β,激活SMAD2/3信号通路,抑制PEG3的表达,引起OT和OTR的表达增加。7.在结肠炎的不同时期,结肠巨噬细胞的极化方向实验性结肠炎可以分为炎症期和修复期,不同时期巨噬细胞极化的方向不同。我们通过构建DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型,来探究在结肠炎不同时期巨噬细胞的极化方向。结果表明,前两周,小鼠体重明显下降,结肠长度明显缩短,DAI和组织学评分明显升高,为炎症期。此后进入修复期,小鼠的各项指标逐渐恢复正常。在炎症期,第7天和第14天,结肠LMMP内的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平较对照组明显升高,M1型巨噬细胞的标志物CCL2和iNOS的mRNA水平也明显增加。与此相反,在炎症期,结肠巨噬细胞向M2方向极化不明显。第7天,抗炎因子TGF-β和M2型巨噬细胞的标志物（Chi13、CD206）mRNA的表达较对照组无明显差异;第14天,抗炎因子TGF-β和M2型巨噬细胞的标志物Chil3 mRNA的表达虽有所升高,但是CD206 mRNA的表达较对照组无明显差异。免疫荧光的结果也表明,第7天和第14天（炎症期）,黏膜下的F4-80/iNOS双阳性细胞的数量增加。在修复期,巨噬细胞极化又出现了相反的变化。第21天和第28天,促炎因子IL-6、TNF-α和M1型巨噬细胞的标志物CCL2、iNOS的表达恢复到对照组水平,而抗炎因子TGF-β和M2型巨噬细胞的标志物（Chil3、CD206）的mRNA水平较对照组明显升高。免疫荧光的结果也表明,第14天后F4-80/iNOS双阳性细胞的数量开始下降,第28天,F4-80/iNOS双阳性细胞的数量恢复到正常水平。第49天,以上所有指标都恢复到正常水平。综上所述,在实验性结肠炎的炎症期,结肠巨噬细胞主要向M1方向极化;而在修复期,结肠巨噬细胞主要向M2方向极化。8.在结肠炎的不同时期,OT和OTR的表达变化我们已经在细胞水平上证实巨噬细胞极化影响肠神经元中OT和OTR的表达。然而在结肠炎不同阶段,随着巨噬细胞向不同方向极化,肠道OT和OTR的表达是否会随之发生改变尚不清楚。因此,我们接下来探究了在结肠炎不同时期巨噬细胞极化与OT和OTR表达之间的关系,以进一步证明巨噬细胞极化对OT和OTR表达的影响。在炎症期,结肠巨噬细胞向M1型极化的同时出现结肠LMMP内OT和OTR的表达减少。第7天,OT和OTR的mRNA水平降低到最低。而在修复期,结肠巨噬细胞向M2型极化的同时出现结肠LMMP内OT和OTR表达的增高。第21天和第28天,OT和OTR的mRNA水平明显升高。第49天,OT和OTR的mRNA水平较对照组无明显差异。综上所述,在结肠炎的不同时期,结肠巨噬细胞极化与OT和OTR的表达密切相关,在炎症期,结肠巨噬细胞向M1方向极化的同时出现OT和OTR表达的降低,而在修复期,随着结肠巨噬细胞向M2方向极化的同时出现了 OT和OTR表达的增加。9.D-甘露糖（D-Mannose）对结肠巨噬细胞极化和OT、OTR表达的影响前期研究表明巨噬细胞极化与OT和OTR的表达密切相关。已有研究证明D-mannose抑制巨噬细胞向M1方向极化,因此,我们使用20%D-mannose水溶液喂饮小鼠7天,进一步验证在体情况下肠道巨噬细胞极化改变和结肠LMMP中OT和OTR表达之间的关系。与对照组相比,饮用D-mannose后,虽然小鼠结肠LMMP内三种促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达并未发生变化,但是M1型巨噬细胞的标志物iNOS的mRNA水平明显降低。而M2型巨噬细胞的标志物CD206、Arg1、Chil3、Ym1和抗炎因子TGF-β、IL-10的mRNA水平显著升高。以上结果说明D-mannose抑制结肠巨噬细胞向M1方向极化和促进结肠巨噬细胞向M2方向极化。我们也发现,小鼠饮用D-mannose后,结肠LMMP中OT和OTR的表达水平明显升高。10.巨噬细胞在D-mannose促进OT和OTR表达中的作用为了进一步验证饮用D-mannose后结肠LMMP中OT和OTR表达的升高与巨噬细胞极化相关,我们采用腹腔注射氯膦酸二钠脂质体的方法耗竭全身巨噬细胞。氯膦酸二钠脂质体处理明显使结肠肌层和整个肌间神经丛中的M2型巨噬细胞的数量减少。我们也发现耗竭巨噬细胞后,OT和OTR的mRNA水平较空白对照组无明显差异,但明显低于单纯D-mannose组。以上结果说明D-mannose通过促进结肠巨噬细胞向M2方向极化从而上调OT和OTR的表达。11.PEG3在D-mannose促进OT和OTR表达方面的作用我们曾经在第6部分结果中发现PEG3介导M2型巨噬细胞促进OT和OTR的表达,因此我们进一步验证了 PEG3在D-mannose促进OT和OTR表达方面的作用。我们发现饮用D-mannose的第7天,PEG3的mRNA和蛋白水平较对照组明显降低。腹腔注射SIS3 HCl阻断SMAD2/3信号通路可逆转D-mannose引起的PEG3表达的下调和OT、OTR表达的上调。综上所述,D-mannose通过促进结肠巨噬细胞向M2型极化,激活SMAD2/3信号通路,抑制PEG3的表达,从而促进OT和OTR的表达。小结:1.M1型巨噬细胞通过分泌促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）抑制肠神经元OT和OTR的表达,其作用是通过激活STAT3和NF-κB信号通路实现的;M2型巨噬细胞通过释放TGF-β,激活SMAD2/3信号通路,抑制PEG3的表达,引起OT和OTR的表达增加。2.在实验性结肠炎的炎症期,结肠巨噬细胞向M1型极化,OT和OTR的表达降低,而在修复期,结肠巨噬细胞向M2型极化,OT和OTR的表达升高,说明巨噬细胞的极化与OT和OTR的表达密切相关,进一步说明在体情况下,肠道巨噬细胞的极化影响肠神经元OT和OTR的表达。3.D-Mannose通过抑制结肠巨噬细胞向M1方向极化,促进其向M2方向极化,从而促进OT和OTR的表达。这种作用是通过激活SMAD2/3信号通路,抑制PEG3的表达实现的。4.我们首次解析了巨噬细胞极化对肠神经元OT和OTR表达的影响及其机制,我们此次发现在实验性结肠炎的修复期,OT和OTR的表达增高,这说明OT信号系统参与了炎症组织的修复。我们也曾发现OT抑制巨噬细胞向M1方向极化,促进其向M2方向极化,本实验又发现M1型巨噬细胞激活会导致OT和OTR表达的降低,所以,对于炎症性肠病（Inflammatory boweldisease,IBD）患者,如果给予OT治疗不仅在炎症期抑制炎症的进程,还能在修复期通过促进M2型巨噬细胞的极化和OT信号系统自身的表达从而促进组织的修复。这提示OT可能是一种潜在的药物靶点,为肠道炎症性疾病的治疗提供了新思路。