论文部分内容阅读
肿瘤细胞代谢异常,将主要的产能方式从氧化磷酸化转换为糖酵解。磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)是糖酵解的重要分支,已被证明在多种肿瘤细胞中是上调的。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose 6 phosphate dehydrogenase,G6PD)是PPP的限速酶,已有研究表明G6PD的活性在多种肿瘤组织或细胞系中也是明显增高的。提示是不是可以通过抑制或减弱PPP来达到治疗肿瘤的目的。线粒体是细胞内的能量中心,它对肿瘤的发生、生长、转移和细胞凋亡都有着重要的影响。研究表明,线粒体碎片化和肿瘤发生有密切关系,但有关肿瘤发生中磷酸戊糖途径和线粒体碎片化以及细胞凋亡之间关系的研究报道较少。本课题采用RNAi和G6PD抑制剂脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)(浓度为:0μM、25 μM、50μM、100μM、200μM、300μM)两种方法分别抑制G6PD活性,通过对HepG2细胞的细胞活力、迁移能力、葡萄糖消耗量和乳酸生成量以及线粒体融合分裂蛋白、ROS含量、细胞凋亡相关蛋白的变化检测,探讨NADPH的变化对线粒体碎片化及细胞凋亡的影响。希望获得G6PD与线粒体功能异常及细胞凋亡之间的关系。得到以下研究结果:1.构建了干扰G6PD基因的重组质粒,转染重组质粒后,检测HepG2细胞中G6PDmRNA水平抑制率在70%左右,蛋白水平抑制率在50%左右。2.RNAi G6PD后,HepG2细胞活力有所下降,但没有显著性,而用50μM及以上浓度的DHEA处理对细胞活力影响明显高于干扰。两种处理方法对细胞迁移能力均极显著下调。显示G6PD抑制对肿瘤细胞有一定的抑制作用。3.RNAi结果显示,HepG2细胞葡萄糖消耗量显著性下调,乳酸生成量极显著下调。50μM、200 μM和300 μM DHEA处理组,葡萄糖消耗量显著性下调,乳酸生成量极显著性下降。而100μM DHEA处理组没有显著性变化。4.检测细胞凋亡相关蛋白的表达,RNAi G6PD后,Bax和caspase3在mRNA水平显著下调,但 Bax、cleaved casase9、cleaved caspase3、AMPK在蛋白水平都显著性上调了;ROS含量极显著上调:细胞核染色质边缘化、细胞核体积变小并且出现裂解现象。说明G6PD基因沉默,激活了线粒体内源性凋亡途径。由于Bax和caspase3在mRNA水平显著下调,但Bax和cleaved caspase3在蛋白水平表达上调,说明G6PD基因沉默后,激活了细胞内已有的Bax和caspase3蛋白从而启动细胞凋亡。DHEA低浓度处理后,ROS的增加浓度早于Bax、cleaved caspase3和AMPK蛋白表达,而与cleaved caspase9蛋白表达同步。推测可能通过ROS-Tom20-Bax-caspase3途径诱导细胞凋亡。caspase9在低浓度处理(25 μM DHEA)蛋白表达即被极显著上调,说明其对于G6PD或者说PPP途径的代谢改变,与ROS具有相似的敏感性。5.检测线粒体分裂蛋白drp1和线粒体融合蛋白mfn2的蛋白表达,结果显示,RNAi后drp1和mfn2的蛋白表达都极显著下调。50μM、100μM、200μM、300μM DHEA处理HepG2细胞后,drp1和mfn2表达水平都极显著性下调。表明RNAi和DHEA处理后使HepG2细胞线粒体分裂和融合动力都下调,稳定线粒体,影响癌细胞生长。结论:RNA干扰和抑制剂DHEA处理都可以抑制HepG2细胞G6PD活性,G6PD活性下调后,PPP受到一定程度的抑制,NADPH含量降低,ROS水平升高,线粒体内源性凋亡途径被激活,并且线粒体融合分裂受到抑制,线粒体趋于稳定,使肿瘤细胞生长、增殖、迁移能力下降。但HepG2细胞干扰后,细胞活力没有显著性变化;DHEA处理后,对细胞凋亡相关基因蛋白水平的影响要高于mRNA水平,以上实验结果表明,直接使用抑制剂处理降低G6PD活性可能比干扰的效果要好,DHEA可能是治疗癌症的一个潜在药物。