研究背景肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病,其死亡率仅次于心、脑血管类疾病。而导致癌症患者死亡的一个重要原因是肿瘤细胞的侵袭与转移。在肿瘤的治疗过程中,由于恶性肿瘤易于转移、扩散等原因,至今尚无有效的治疗方法。因此,抑制肿瘤细胞的侵袭与转移成为治疗恶性肿瘤的一个重要手段。肿瘤细胞的转移是一个非常复杂的过程,其中包括肿瘤细胞对细胞外基质的降解,血管壁的穿透以及肿瘤细胞的转移,肿瘤组织新生血管生成等一系列过程。氨肽酶N (Aminopeptidase N, APN, EC3.4.11.2)在此过程中起到了极其重要的作用。APN也被称为CD13,是一种Ⅱ型膜结合型锌离子依赖性金属蛋白酶,最初是在鉴别人白血病分类的特异性标记物时提到的。该蛋白的功能较为复杂,在不同的组织行使不同的功能,但主要与其蛋白水解活性有关。APN能水解寡肽,尤其是从小肽链的N端降解中性氨基酸,参与生物活性肽的激活或降解、肿瘤细胞侵袭时细胞外基质的降解、抗原呈递细胞的抗原呈递等多种生物学过程。因为APN分布广泛,其功能在很大程度上取决于其分布,在肠内绒毛上缘,APN参与小肽的降解和氨基酸的清除；在突触膜内,APN能使内啡肽和脑啡肽降解失活；在肾中,APN参与肾素-血管紧张素系统功能调节,能降解血管紧张素Ⅲ。另外,APN还参与炎症反应,作为病毒受体介导病毒感染等。鉴于APN在肿瘤新生血管生成中的重要作用,该酶的信号转导在血管内皮细胞中研究的较为活跃。在肿瘤微环境下,活化的内皮细胞中APN的表达主要受血管生长信号在转录水平上的调节,APN的转录受到两条Ras信号通路的调节：Ras/分裂素激活的蛋白激酶MAPK通路和3-磷脂酰肌醇激酶PI3K通路。阻断这两条信号通路中的任意一条都不能完全抑制APN mRNA的转录,这两条信号通路最终汇聚于Erk,抑制Erk才能完全抑制APN的表达。内皮细胞中,胞内信号通过磷酸化激活转录因子Ets-2,磷酸化的Ets-2结合APN基因的近端启动子,启动APN的转录,发挥生物学功能,调节内皮细胞的生理功能。APN蛋白的胞内部分只有8-10个氨基酸残基,因此,一般认为APN不能直接向胞内传递信号,但APN的底物包括IL-6、IL-8、神经肽、脑啡肽等,APN对这些底物的降解会一定程度上影响其信号转导,至于APN是否还通过其它细胞因子影响信号转导,目前还不清楚。原发肿瘤或继发肿瘤生长到超过1-2 mm3时,就必须有新生血管生成提供足够的血液供应,新生血管生成是一个非常复杂的过程,这包括受血管生长因子刺激的内皮细胞穿过基底膜侵袭、转移、增殖等过程,并最终在肿瘤组织内形成血管结构。血管生成受多种肿瘤细胞或宿主细胞分泌的细胞因子的调节,在肿瘤微环境中,内皮细胞APN mRNA和蛋白水平都有上调,用抗APN的单克隆抗体或功能性抑制剂如Bestatin,能显著的抑制毛细管网络的形成,这表明此金属蛋白酶在新血管生成后期是一个重要的血管生成激活剂。细胞外基质的主要成分是多糖和纤维蛋白,因此,通过以胶原和蛋白聚糖为基本骨架的纤维网状复合物,细胞外基质将细胞外与细胞内连成一个有机的整体,这对维持细胞连接的稳定性和细胞间的信号转导都起到了非常重要的作用。同时这对肿瘤细胞的转移也设置了障碍,因此基底膜的降解是肿瘤细胞转移过程中的重要环节,APN因其蛋白水解活性在肿瘤细胞的生长、侵袭过程中起非常重要的作用。细胞外基质中Ⅳ型胶原就是APN的底物,在非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌中,APN的表达可能导致患者预后较差,并且推测APN表达与肿瘤细胞的转移扩散存在相关性。另外,APN还参与了免疫调节过程和病毒的感染。目前已知APN能通过降解抗原肽N端的数个氨基酸干扰抗原呈递；在造血系统中,细胞表面的APN能调节细胞的局部微环境影响造血细胞的分化。病毒感染细胞的过程需要细胞表面受体的介导,而APN正是多种病毒的细胞表面受体,病毒与受体结合后,引发细胞的内吞作用,病毒得以进入细胞。鉴于以上原因,本研究课题致力于筛选靶向APN的抗肿瘤先导化合物。通过一系列试验,评价了各受试化合物的抗肿瘤活性,并最终筛选得到化合物13f作为APN抑制剂类先导化合物进行研究、开发。APN抑制剂的抗肿瘤机制一直不清楚,本课题还初步研究了APN抑制剂的抗肿瘤作用机制,发现Fascin蛋白在APN抑制剂的抑制细胞迁移过程中发挥重要作用。另外,我们还发现不同物种来源的氨肽酶N空间结构对APN抑制剂的活性评价存在影响。因此,对化合物进行活性评价时,应以人源氨肽酶N进行最终的评价。现将各部分的主要内容介绍如下：第一部分APN抑制剂的活性评价本部分内容,主要从分子和细胞水平上研究本实验室首次设计合成的环酰亚氨类APN抑制剂的生物活性。小分子环酰亚胺类肽是基于APN为作用靶点而设计合成的一系列APN抑制剂类抗癌先导化合物,其设计思想结合了肽类似物和构象限制原则,并且此类化合物的药效团结构与Bestatin较为相似。另外,APN的功能与血管生成和肿瘤细胞的侵袭密切相关,而受试化合物也确实能抑制内皮细胞血管生成及肿瘤细胞的侵袭。首先,我们用流式细胞术检测了不同肿瘤细胞APN的表达情况,结果表明：人髓性白血病细胞HL-60、人卵巢透明细胞癌ES-2、人肺泡上皮细胞癌A549、人肝癌细胞PLC/PRF/5 APN表达量相对较高,人肝癌细胞HepG2、H7402、人胶质瘤细胞A172、U87 APN表达量相对较低,而人髓性白血病细胞K562不表达APN或表达量非常低。根据试验数据及文献报道,我们选用HL-60、ES-2细胞检测APN抑制剂的活性。根据本课题组李乾斌博士测定的酶活性数据,我们选出一系列化合物,用细胞模型评价了其抗肿瘤活性。MTT试验结果表明,所有化合物均能够在一定程度上抑制HL-60细胞的活力,结合抑酶活性数据及细胞活力抑制数据,我们筛选出三个化合物：13d、13f、22f,做进一步的活性评价,检测了抑制剂对HL-60细胞表面APN的抑酶活性；受试化合物对卵巢癌ES-2、肺癌A549细胞活力的影响,结果表明受试化合物均能明显的抑制APN的活性及肿瘤细胞的活力。另外,根据氨肽酶N的生物学功能,我们还检测了这三个化合物对细胞周期、血管生成及肿瘤细胞侵袭的影响。受试化合物均能明显的影响HL-60细胞有丝分裂；抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成及卵巢癌ES-2细胞侵袭。但对低表达APN的K562细胞的活力影响不大,这表明受试化合物对APN具有一定的选择性。另外,我们还测定了受试化合物对APN的抑制常数；应用计算机SYBYL软件做了分子动力学模拟,构建了3D-QSAR模型,用于分析抑制剂的构效关系并指导新的APN抑制剂的合成。综合所有活性试验数据,我们选定化合物13f开发潜力最大,可能成为新的APN抑制剂类抗肿瘤药物。该研究结果发表在Fundam Clin Pharmacol.2010 Jul15上。第二部分APN抑制剂抗肿瘤细胞迁移机制的研究Fascin也被称为Fascin 1,是一种能与肌动蛋白结合的球状蛋白,该蛋白主要把肌动蛋白丝组织成严密的束构成层状粘足和丝状伪足,而这两种结构是细胞突触的主要成分,细胞突触在细胞感应外部环境、细胞迁移时起非常重要的作用,因此,在细胞迁移过程中,Fascin是一个非常重要的蛋白。在许多癌症中Fascin表达都上调,例如：胃癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌。因此,Fascin已成为一个新型的候选肿瘤标志物和治疗靶点。本部分内容主要研究阳性对照药(Bestatin)和我们首次合成的(13f) APN抑制剂的抗肿瘤细胞迁移机制,本研究首次发现Fascin表达下降与APN抑制剂的抑制迁移活性有关。MAPK信号通路中Erkl/2的磷酸化也受APN抑制剂的时间、浓度依赖性影响。然而,MAPK信号通路阻断剂PD98059并不能抑制Fascin的表达。另外,我们还发现APN抑制剂通过PI3K/Akt信号通路调节MMP-2的表达。在试验过程中,我们发现APN抑制剂对高表达APN的卵巢癌ES-2细胞的形态有影响,加药处理后细胞变的细长,类似于成纤维细胞,而对于低表达APN的肝癌HepG2细胞,影响不大。细胞形态与细胞骨架密切相关,因此我们推测,细胞迁移速率也会随细胞骨架而受到影响。划痕试验结果表明Bestatin和13f均能明显的抑制ES-2细胞的迁移,Bestatin较13f活性高。随后,我们用Western blot试验检测了细胞骨架相关蛋白Fascin的表达情况。结果表明,APN抑制剂抑制卵巢癌ES-2细胞迁移的同时,Fascin的表达也受到了影响,为了确认Fascin是否在APN抑制剂抑制细胞迁移过程中起重要作用,我们构建了pcDNA3.1-Fascin质粒,与转染pcDNA3.1空质粒的对照组相比,过表达Fascin确实能影响APN抑制剂的抑制细胞迁移作用。因此,综合相关数据,我们得出结论：APN抑制剂是通过抑制Fascin蛋白的表达抑制卵巢癌ES-2细胞的迁移。大鼠乳腺上皮细胞Con8中,TGF-a能通过MEK-MAPK依赖性的通路抑制地塞米松对Fascin的下调作用,因此我们猜测APN抑制剂是否也通过MAPK信号通路下调Fascin。然而,Western blot结果表明尽管APN抑制剂能以时间、浓度依赖性的方式抑制Erkl/2的磷酸化,但MEK抑制剂PD98059并不能抑制卵巢癌ES-2细胞Fascin的表达。因此,卵巢癌ES-2细胞中,Fascin的表达不受MAPK信号通路的调节。另外,我们发现APN抑制剂能上调基质金属蛋白酶MMP-2 mRNA、蛋白的水平,并且APN抑制剂也能上调Akt磷酸化,同时P13K激酶特异性抑制剂LY294002不仅能阻断PI3K依赖的Akt磷酸化,还能浓度依赖性的抑制MMP-2的表达,所有这些数据都表明APN抑制剂可以通过PI3K/Akt信号通路上调MMP-2的表达。该研究结果已投稿。第三部分不同物种来源的氨肽酶N空间结构对APN抑制剂活性评价的影响本课题组合成的新型APN抑制剂161可以明显的抑制猪氨肽酶N的活性,且抑制常数也与阳性药Bestatin相当。然而,我们用人肿瘤细胞检测其活性时,161并不能有效的抑制氨肽酶N的活性及细胞活力、细胞迁移和侵袭。两个化合物抑制小鼠APN活性时,抑制率也相差较大。另外,我们用HPLC检测,161并没有被细胞降解。因此,我们推测可能是由于不同物种来源的APN三维空间结构的差异导致两个化合物的抑酶活性相差较大。借助计算机辅助分子模拟分析表明,由于空间结构上的不同,化合物161在人和猪APN结合位点的结合方式存在较大差别。因此,用猪氨肽酶N进行APN抑制剂的活性筛选只能作为初筛手段,而真正的活性评价应以人氨肽酶N作为酶源。该研究结果发表在Biol. Pharm. Bull.2010 Oct; 33(10)上。结论本研究首先评价了一系列APN抑制剂的活性,并从中选出三个较有潜力的化合物进行后续的研究,通过多种活性评价试验,最终选定化合物13f活性较好,有望作为APN抑制剂类抗肿瘤先导物进行开发。我们还对APN抑制剂的抗肿瘤细胞迁移机制,进行了初步的探讨。研究发现Fascin在肿瘤细胞迁移过程中起到了非常重要的作用,APN抑制剂也正是通过抑制Fascin的表达,抑制肿瘤细胞迁移。对信号通路的研究表明,APN抑制剂对MAPK、PI3K/Akt信号通路均有影响,通过PI3K/Akt通路,APN抑制剂能上调基质金属蛋白酶MMP-2的表达。另外,我们还发现,由于空间结构上的不同,APN抑制剂与人和猪氨肽酶N的结合方式存在较大差别。因此,用猪氨肽酶N进行APN抑制剂的活性筛选只能作为初筛手段,而真正的活性评价应以人氨肽酶N作为酶源。上述研究筛选到一个活性较高、新合成的APN抑制剂,并对APN抑制剂的抗肿瘤细胞迁移机制进行了初步探讨,这对合成新型的APN抑制剂,以及肿瘤治疗,提供了一定的理论和实验基础。