论文部分内容阅读
研究背景视网膜变性(retinal degeneration,RD)是一类视网膜退行性致盲性疾病。干细胞移植被认为是治疗RD最有潜力的治疗方案之一,但其治疗机制尚不明确。国内外的研究和我们课题组前期研究都证实视网膜神经祖细胞(neural progenitor cells,NPCs)在移植后能分化为成熟感光细胞替代变性的视网膜细胞并与宿主视网膜整合。近来发现参与分化整合的NPCs数量非常少,故推测细胞替代机制可能不是NPCs发挥治疗作用的主要机制。多个课题组的研究发现,移植的NPC和宿主细胞之间的物质交换可能是延缓宿主细胞变性进程的主要机制。NPC能分泌多种神经营养因子,以及包括外泌体在内的各类细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs),以便和微环境中各类细胞进行调控和交流。外泌体(exosomes)属于细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的一种。多项研究报道它可以介导移植干细胞和宿主细胞间的细胞间通讯,NPC来源外泌体(NPC-exos)对损伤的中枢神经系统具有神经保护作用。尚无研究探讨NPC-exos是否参与介导了NPCs在RD中的神经保护作用,且尚不清楚直接移植NPC-exos能否治疗RD。研究报道,外泌体可以通过对微环境及微环境中的靶细胞传递其中或其表面的包括miRNA等在内的生物活性分子来调控炎症反应以及诱导组织再生。NPC-exos中是否含有调控炎症反应的micro RNAs(miRNAs),尚不清楚。在RD发展过程中,视网膜小胶质细胞在视网膜变性早期通过吞噬不能被代谢的细胞碎片而发挥部分保护作用,但随着病程进展,小胶质细胞很快从静息态转化为激活状态,向外核层和视网膜下腔迁移,并释放包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)及白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)在内的炎症因子及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)等,触发过度的炎症反应并对感光细胞产生进一步损伤,加快RD的进展。研究证实NPC-exos的神经保护作用与其被靶细胞内化(internalization)相关,CNS的小胶质细胞和神经元会优先于其他神经细胞内化外源性外泌体。在视网膜众多的细胞中,具有吞噬功能的细胞有:视网膜色素上皮细胞(retinal pigmented epithelium,RPE)、Müller细胞、小胶质细胞,mNPC-exos在视网膜中的靶细胞是什么细胞,尚无研究报道。视网膜小胶质细胞是否能特异性吞噬外源性外泌体,以及内化外泌体后其miRNAs是否能调控小胶质细胞在RD病程中的作用,需要实验证实。研究假设本研究假设:NPC-exos介导了NPCs移植改善RD视功能的作用,可能是通过NPC-exos中靶向抑制炎症相关基因的miRNAs而特异性抑制小胶质细胞的激活,从而对感光细胞产生保护作用。研究方法与结果本研究分为三个部分:第一部分mNPC-exos及hNPC-exos生物学特性研究1.mNPCs及hNPC的原代培养及鉴定分别通过悬浮培养和条件培养基贴壁培养的方法稳定并高效地扩增获得mNPC和hNPC,鉴定结果显示:两种NPCs具有自我更新能力,表达干细胞标志物,并具有多向分化潜能。提示:本研究方法获得的mNPCs和hNPCs可以作为大量获取mNPC-exos和hNPC-exos的来源。2.mNPC-exos提取纯化、鉴定及生物学特性通过差速离心结合蔗糖密度梯度超高速离心方法提取和纯化得到mNPC-exos。采用蛋白印迹检测(Western blot,WB)、透射电镜和纳米粒径分析仪(nanosight analysis,NTA)鉴定,结果提示:本研究所用蔗糖密度梯度超高速离心方法提取纯化可得到纯度高,状态良好的mNPC-exos,可用于后续研究。同时我们对mNPC-exos内容物中miRNA测序,得到mNPC-exo的miRNA表达谱。3.hNPC-exos提取纯化、鉴定及生物学特性利用上述方法我们首次提取和纯化得到人胚眼NPC-exos,采用WB、透射电镜及NTA鉴定,结果提示:本研究所用方法提取纯化得到hNPC-exos可行,且获得hNPC-exos纯度较高,状态良好,可用于后续研究。同时我们也对hNPC-exos内容物中miRNAs进行测序,首次获得人胚眼NPC-exo的miRNA表达谱。4.mNPC-exos及hNPC-exos生物学特性对比通过比较hNPC-exo-miRs和mNPC-exo-miRs,我们发现有的miRNAs中有256种miRs是两种外泌体共有的(占总已知miRs种类数量的24.03%),提示两者在功能上可能有相似性;通过ingenuity pathway analysis(IPA)预测,我们找到29种NPC-exo-miRs可能参与调控了54个免疫疾病或炎症反应相关的靶基因。上述结果提示:mNPC-exos及hNPC-exos富含多种miRNA,这可能是其在细胞治疗RD中调控和保护宿主细胞的分子机制。第二部分mNPC-exos及hNPC-exos移植治疗视网膜变性的研究1.RCS大鼠视网膜下腔移植mNPC-exos对视功能的保护作用RCS大鼠视网膜下腔移植mNPC-exos,fERG检测和光栅视动反应检测结果都提示:移植mNPC-exos可保护RCS大鼠视功能,延缓RD进展,该保护作用至少可以维持至术后28天。2.RCS大鼠视网膜下腔移植mNPC-exos对外核层的保护作用通过统计RCS大鼠各时间点各组视网膜移植区和非移植区视网膜外核层细胞层数变化,我们发现:mNPC-exos能明显缓解移植区域ONL变薄;通过TUNEL染色统计外核层凋亡细胞数量,我们发现:RCS大鼠移植mNPC-exos后,移植区局部ONL细胞凋亡显著减少,并且该保护作用可以至少持续到移植后14天。以上结果首次证实了:RCS大鼠视网膜下腔移植mNPC-exos短时间内即可对感光细胞产生保护作用。3.RCS大鼠视网膜下腔移植hNPC后分泌外泌体对RCS大鼠视网膜下腔移植hNPC术后28天的视网膜组织切片进行h CD63抗原免疫荧光染色,首次示踪了RCS大鼠视网膜下腔移植hNPC-exos,结果提示:移植到RCS大鼠视网膜下腔的hNPC在移植后仍分泌外泌体,hNPC-exos可能介导了hNPCs对RCS大鼠的治疗作用。第三部分mNPC-exos及hNPC-exos移植治疗视网膜变性的机制研究1.mNPC-exos被RCS大鼠视网膜小胶质细胞特异性内化采用慢病毒感染的方法示踪RCS大鼠视网膜下腔移植的mNPC-exos,证实了RCS大鼠视网膜下腔移植的mNPC-exos,在移植后被视网膜下腔的小胶质细胞特异性内化。2.mNPC-exos抑制RCS大鼠视网膜小胶质细胞激活利用RCS大鼠分析了mNPC-exos视网膜小胶质细胞数量的影响,结果提示:RCS大鼠视网膜移植mNPC-exos可抑制视网膜小胶质细胞的激活,其抑制作用可持续到移植后14天。3.mNPC-exos通过抑制激活的小胶质细胞保护感光细胞通过LPS诱导激活BV2小胶质细胞,体外模拟RD病程中激活的小胶质细胞;通过LPS诱导激活的小胶质细胞/感光细胞共培养体系,体外模拟激活小胶质细胞触发感光细胞的损伤。证实了mNPC-exos通过抑制共培养中小胶质细胞的激活,间接发挥抗感光细胞凋亡的作用。4.mNPC-exos抑制RCS大鼠视网膜小胶质细胞激活相关信号通路通过转录组测序,KEGG和IPA分析,发现mNPC-exos调控了RCS大鼠视网膜小胶质细胞多条炎症相关的信号通路,提示:mNPC-exos下调RCS大鼠视网膜小胶质细胞激活相关通路基因表达,抑制小胶质细胞激活相关信号通路,从而抑制RCS大鼠视网膜小胶质细胞的激活。5.mNPC-exos及hNPC-exos中miRNAs靶向调控与小胶质细胞激活相关的基因通过连锁分析NPC-exos miRNA表达谱与小胶质细胞转录组差异基因,发现NPC-exos含有的一组miRNAs,能靶向抑制小胶质细胞TNF-α,IL-1β及COX-2转录组表达,提示:通过传递miRNA抑制靶基因表达,可能是RCS大鼠视网膜下腔移植NPC抑制小胶质细胞的机制之一。6.mNPC-exos及hNPC-exos抑制小胶质释放TNF-α、IL-1β及COX-2利用RT-q PCR和ELISA检测证实mNPC-exos通过下调LPS诱导激活的BV2小鼠小胶质细胞中TNF-α,IL-1β及COX-2转录组表达,抑制相应分泌蛋白的分泌;hNPC-exos被LPS诱导激活的hmg SV40人小胶质细胞内化后,下调TNF-α,IL-1β及COX-2转录组表达。研究结论1.本研究率先报道了:RCS大鼠视网膜下腔移植mNPC-exos,可以减少视网膜感光细胞凋亡,改善视功能,缓解RD病程进展。首次从外泌体角度部分揭示了NPCs移植治疗RCS大鼠的分子机制,为提高RD干细胞移植的治疗效果提供了新思路,为NPC-exos移植治疗RD成为新的临床治疗方案提供依据。2.本研究首次报道了:mNPC-exos在RCS大鼠视网膜中的直接靶细胞是视网膜小胶质细胞,揭示了:移植mNPC-exos早期对视网膜感光细胞的保护是经由对小胶质细胞抑制间接实现的。3.本研究连锁分析mNPC-exo-miRs与小胶质细胞转录组差异基因,找到mNPC-exos中关键miRNAs,并率先报道:mNPC-exos抑制小胶质细胞的机制是通过抑制TNF-α,IL-1β及COX-2基因转录组表达,减少相应感光细胞损伤因子释放,进而减少感光细胞凋亡。4.本研究首次示踪了RCS大鼠视网膜下腔移植人胚眼NPC分泌的外泌体,研究了hNPC-exos miRNA表达谱,并对比发现其与mNPC-exos miRNA表达谱高度相似,具有调控包括TNF-α,IL-1β及COX-2在内的炎症相关基因的关键miRNAs,为后续开展hNPC-exos移植治疗RD的新策略提供理论依据。