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除草剂氯嘧磺隆被广泛用于大豆田阔叶杂草的防治,具有除草效率高、对人畜低毒等优点。然而长期过度施用也带来了一系列的问题,如土壤退化、轮作障碍以及对土壤微生物的潜在抑制作用等。本研究分离到一株具有高效降解氯嘧磺隆活性的菌株,命名为CHL1,该菌株同时对甲磺隆、苯磺隆具有高效降解活性。多相鉴定结果表明该菌株为甲基孢囊菌科的潜在新属。借助Illumina Hiseq2000测序平台,对菌株CHL1做了全基因组测序,填充了数据库的空白,为解析氯嘧磺隆的代谢途径提供参考。该菌株被用于氯嘧磺隆污染土壤的修复实验和植物解毒实验,结果表明菌株CHL1对土壤中不同浓度(10μg/kg-1000μg/kg)氯嘧磺隆均表现出高效的降解活性,显著改善了后茬敏感作物玉米的各项生长指标,缓解了土壤微生物受到的抑制作用,且两次接种菌株CHL1可显著提高修复效果。该菌株体内参与除草剂降解的第一步去酯化反应的酯酶SulE,被首次固定化在一种环境友好、可降解的载体-交联聚(γ-谷氨酸)/明胶水凝胶(CPE)中,显著改善了酯酶SulE的热稳定性、pH稳定性及可重复利用性,提高了其在不同pH值土壤和溶液中的氯嘧磺隆降解效率。 当以氯嘧磺隆为唯一碳源时,菌株CHL1在30℃,4天内对初始浓度为50mg/L氯嘧磺隆的降解率可达到95%以上。此外,该菌株还可以高效降解苯磺隆和甲磺隆。菌株CHL1对土壤中不同浓度(10μg/kg-1000μg/kg)氯嘧磺隆均表现出显著的降解活性。当有菌株CHL1添加时,分别经过15、30、45天的培养,10μg/kg、30μg/kg、50μg/kg氯嘧磺隆处理组土壤中的氯嘧磺隆残留量已经低于检测限;即使在高浓度(100μg/kg和1000μg/kg)氯嘧磺隆处理组,接种菌株CHL1的土壤中氯嘧磺隆残留量也要显著低于同剂量未接种土壤。 植物解毒实验显示菌株CHL1可以显著缓解氯嘧磺隆对玉米的抑制作用。在未接种菌株CHL1的土壤中,10μg/kg的氯嘧磺隆剂量即可显著影响玉米的发芽率、发芽时间、株高、鲜重及主根长等指标。高剂量的氯嘧磺隆的抑制作用更为严重和持久。当添加有菌株CHL1时,氯嘧磺隆的降解速率显著加快,其对玉米造成的毒害作用得到了显著缓解。 菌株CHL1可以显著缓解氯嘧磺隆对土壤微生物群落的抑制作用。高浓度的氯嘧磺隆会显著降低微生物生物量,增加微生物的压力指数,对细菌、真菌以及氮循环功能基因的丰度都有显著抑制作用,而菌株CHL1的添加可显著缓解氯嘧磺隆对微生物的抑制作用,而且接种菌株两次具有更好的解毒效果。在中、低浓度氯嘧磺隆处理组中,菌株CHL1的添加可以使微生物生物量更快的恢复至对照水平;在高浓度氯嘧磺隆处理组中,添加菌株CHL1虽然不能使微生物生物量恢复至对照水平,与未接种处理组相比也有显著的缓解。在接种菌株CHL1一次的处理组中,细菌、真菌、AOA和nirS指示基因的拷贝数可在60天修复实验后恢复至对照水平;nifH基因的拷贝数则需要两次接种菌株CHL1才能恢复至对照水平;而AOB和nirK基因的拷贝数无论接种与否到实验结束时都没能恢复至对照水平。 与自由酶相比,固定化酶CPE-SulE的热稳定性、pH稳定性及可重复利用性都有了显著改善。此外,CPE-SulE在不同pH值土壤和溶液中都表现出更高的氯嘧磺隆降解效率,特别是在酸性条件下效果尤为显著。即使在pH5.0的缓冲液和pH4.95的土壤中,固定化酶CPE-SulE对氯嘧磺隆的降解效率(33.6%和45.7%)也要显著高于自由酶SulE(10.5%和19.1%)。 多相鉴定结果表明该菌株为革兰氏阴性、好氧、不产芽孢、不可运动、无色杆菌,增殖方式为二分裂;该菌株的主要脂肪酸为18∶1w7c/18∶1w6c(75.78%),16∶0(15.75%);呼吸醌的主要类型为Q10;主要的磷脂为磷脂酰乙醇胺、心磷脂和卵磷脂;基因组DNA中G+C%为69.4%;与模式菌株DSM22840T和DM9T的DNA-DNA杂交率很低,分别为22.41±1.98%和25.14±4.31%;基于16S rDNA构建的系统发育树中菌株CHL1代表了甲基孢囊菌科的一个独立分支,并未与其他属的模式菌株聚在一起。因此,菌株CHL1属于甲基孢囊菌科的一个潜在新属。 借助Illumina Hiseq2000平台,对菌株CHL1的基因组进行测序,共获得了3.16G的原始数据,共计5,677,839bp的碱基序列被拼接装配为188个contigs,40个scaffolds。基因序列总长占到基因组的88.4%,基因序列平均长度约为871bp。通过与string数据库比对,对2272个蛋白编码基因进行了功能注释和预测,归为23个COG分类。通过KEGG分析,得到199张代谢图谱,其中有37张与异源物质的代谢相关。基因组测序分析为阐述菌株降解磺酰脲类除草剂的代谢途径提供依据。 综上所述,我们的研究结果表明菌株CHL1属于甲基孢囊菌科的一个潜在新属,具有原位修复氯嘧磺隆污染土壤的潜力。而固定化则拓宽了酯酶SulE的适用范围,改善了其适应性,而这些在氯嘧磺隆的原位修复中至关重要。