第一部分风疹病毒E72-296亚单位疫苗的制备和有效性评价研究背景风疹病毒(Rubella virus, RV)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员,为单股正链的RNA病毒,通常在一般人群中引起温和的疾病,但孕妇感染RV能导致流产、死胎或胎儿出生缺陷,即先天风疹综合征(Congenital rubella syndrome,CRS)。目前使用的RV疫苗均为减毒活疫苗,接种孕妇存在安全隐患,接种AIDS儿童和免疫缺陷人群可导致严重的并发症。风疹基因工程亚单位疫苗由于其安全性高于减毒活疫苗,可接种孕妇、AIDS儿童和免疫缺陷人群,是目前风疹疫苗的研究热点。RV的E1蛋白是RV的包膜糖蛋白,分子上包含重要的T细胞、B细胞和抗体中和表位,在动物体内能够引起体液免疫和一定的细胞免疫。E1蛋白上含有四个中和抗体表位,分别是E1(221-239), E1(234-252), E1(254-285)和E1(272-285)。其中,E1(221-239)被认为是主要的中和表位,E1(272-285)被认为含有T细胞表位和诱导中和抗体的表位。有多个研究用原核、毕赤酵母和CHO细胞等系统表达了包含这些表位的E1全蛋白和蛋白区段,并发现E1蛋白具有抗原性,在BALB/c小鼠中能引起体液免疫,使小鼠产生针对RV攻击的保护力。目的获得高表达的纯化的风疹病毒(rubella virus, RV) E72-296蛋白,制备RV E72-296亚单位疫苗。检测亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠后的体液免疫和细胞免疫学指标,通过攻毒实验对E72-296蛋白亚单位疫苗进行安全性和免疫效果评价,最终获得安全有效的风疹病毒基因工程亚单位疫苗。方法本课题选取E1蛋白胞外区段,进行毕赤酵母表达基因的密码子优化全基因合成表达载体pGAPZαA-Ei1-441后,运用分子生物学技术成功构建表达载体pGAPZαA-E25-395、pGAPZaA-E72-395, pGAPZaA-E72-304和pGAPZαA-E72-296,将五种载体分别转化入毕赤酵母菌,通过Zeocin诱导获得E72-296蛋白在酵母表达上清中分泌表达。将酵母上清液过滤后用SP-Sepharose阳离子交换柱层析纯化,Zeba脱盐柱脱盐处理,浓缩管浓缩后进行SDS-PAGE、Western blot (WB)、 MALDI-TOF质谱分析和糖链染色鉴定。纯化的蛋白样品用BCA法测定蛋白浓度,进一步计算蛋白的表达量。纯化的蛋白与明矾佐剂次免疫BALB/c小鼠后,每次免疫间隔两周,第三次免疫后10天处死小鼠,无菌取脾脏并眼球取血制备血清。脾脏分离脾细胞进行脾淋巴细胞增殖实验和NK细胞活性检测；用ELISA法与抗体中和实验分别检测血清中抗RV的IgG水平与中和抗体水平；用ELISA法检测血清中IL-2、IL-5、IL-10和IL-12的含量。进行三次免疫的小鼠10天后进行攻毒实验,攻毒2天后处死小鼠,称重,眼球取血获得小鼠全血进行RT-PCR检测RV；全血离心后所获血清用ELISA法检测IL-2、IL-5、IL-10和IL-12的含量；无菌取小鼠脾脏、肝脏、肾脏、心脏和肺脏进行HE染色和免疫组化染色分析病理变化和病毒感染情况。用纯化的蛋白作为包被抗原改进传统以灭活病毒作为抗原的ELISA检测方法。浓度为0.46mg/ml纯化的蛋白与抗血清依照交叉连续稀释法组合抗原包被量、一抗稀释量。E72-296蛋白包被稀释倍数：1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280、1：2560;一抗稀释倍数：1：25、1：50、1：100、1：200、1:400。ELISA方法的步骤参照Trinity生物技术公司的RV IgG检测试剂盒的步骤,其中一抗、二抗和显色的时间设定为1h。用建立好的以E72-296蛋白作为抗原的ELISA试剂盒与商用Trinity生物技术公司的RV IgG检测试剂盒共同检测从齐鲁医院检验科留存的随机血清样本80例,采用Kappa系数作为两种检验方法一致性的检验指标。结果1.风疹病毒基因工程亚单位疫苗主要成分E72-296蛋白的制备经过SDS-PAGE、WB、MALDI-TOF质谱分析和糖链染色等一系列实验,初步验证纯化蛋白的分子量为21.6kDa,产量为106.88mg/L。2.E72-296蛋白的免疫原性评价E72-296蛋白免疫组小鼠血清特异性IgG水平、中和抗体水平和小鼠脾淋巴细胞的增殖能力与RV减毒疫苗免疫组的差别均无统计学意义(P>0.05),均高于阴性对照组(P<0.01)；蛋白免疫组小鼠血清与病毒中和后接种BHK21细胞的细胞存活率个高于病毒感染细胞的细胞存活率(P<0.01)；通过检测疫苗免疫小鼠后小鼠体内NK活性判定疫苗对小鼠NK细胞的毒性,活性不低于阴性对照说明疫苗对小鼠NK细胞无毒性,E72-296蛋白对小鼠NK细胞的活性与阴性对照组差别无统计学意义[36.01%±7.04%vs37.60%±2.13%(P>0.05)],高于风疹病毒[36.01%±7.04%vs22.28%±1.77%(P<0.05)和风疹病毒减毒疫苗[36.01%±7.04%vs21.36%±2.61%(P<0.05)]免疫小鼠后NK细胞的活性；免疫38天后小鼠血清中的细胞因子(IL-2, IL-5, IL-10, IL-12)水平与阴性对照组差别均无统计学意义(P>0.05)。这表明E72-296蛋白在小鼠体内能引起与RV减毒疫苗相似的较高的体液免疫和一定程度的细胞免疫,而E72-296蛋白对NK细胞的毒性较小,相对于减毒疫苗更为安全。3.E72-296蛋白的保护性评价HE染色和免疫组化染色结果表明攻毒后预先免疫E72-296亚单位疫苗的小鼠脏器未发生病理变化,未检测到病毒存在,免疫组化IOD值与阴性对照组差别无统计学意义(P>0.05),低于出现病毒血症的阳性对照组(P<0.01)。E72-296蛋白免疫后攻毒组小鼠的全血进行RT-PCR未检测到病毒,而出现病毒血症的小鼠全血中检测到病毒。以上结果说明E72-296蛋白作为亚单位疫苗候选蛋白是安全有效的。4.E72-296蛋白在检测风疹病毒抗体中的应用依照交叉连续稀释法组合抗原包被量和一抗稀释量进行间接ELISA检测RV抗体方法建立的条件优化,得到最佳抗原浓度为1.44ng,最佳血清稀释比为1：25。用建立的间接ELISA法检测临床血清样品,与商用抗体检测试剂盒检测结果进行统计分析发现用E72-296蛋白做抗原阳性检出率要高于用灭活病毒粒子做抗原的商用抗体检测试剂盒,这说明E72-296蛋白具有更为优越的检测特点,可作为临床检测试剂的候选。结论本课题通过SP强阳离子层析和脱盐柱获得了纯化的RV E1蛋白72-296区段E72-296蛋白,用E72-296蛋白做抗原免疫BALB/c小鼠,获得了较强的针对RV的特异性IgG抗体和中和抗体；E72-296蛋白能够刺激小鼠的脾T淋巴细胞增殖,但增殖水平不高；E72-296蛋白对NK的细胞活性无明显毒性,而RV减毒疫苗显著降低了NK细胞的活性,说明E72-296蛋白较RV减毒疫苗更为安全；免疫的小鼠进行攻毒实验未检测到病毒血症的存在,说明E72-296蛋白作为RV亚单位疫苗的主要成分能够提供一定程度的有效保护。第二部分风疹病毒E1蛋白中和表位区疏水氨基酸和极性带电氨基酸突变分析研究背景RV E1(221-239)区域是RV E1蛋白上的主要中和表位,与个体产生针对RV的保护力密切相关。RV BCH-178肽已作为ELISA实验中的包被抗原用来检测个体血液中的RV中和抗体水平,确认了BCH-178肽作为检测抗体水平试剂的重要作用。然而,BCH-178肽上与抗体免疫反应性和抗原性相关的关键氨基酸还不清楚。抗原与抗体结合主要依靠抗体结合位点上的疏水氨基酸和极性带电氨基酸与抗体上的相应氨基酸通过范德华力、氢键或离子键相作用。有研究发现在抗原-抗体复合物中,极性／疏水氨基酸残基提供的能量约占到总能量的81%,抗原上的精氨酸,赖氨酸,天冬酰胺和天冬氨酸为抗原-抗体结合提供50%的能量。另有研究认为蛋白或多肽上暴露于溶剂中的带正电的氨基酸对于抗原-抗体的结合极为重要。BCH-178肽上的疏水氨基酸和极性带电氨基酸在抗原抗体结合过程和免疫原性方面的作用至今没有报道。目的确定RV的E1蛋白中和表位区的疏水氨基酸和极性带电氨基酸对BCH-178抗原肽的免疫反应性和免疫原性的影响和关键氨基酸；阐明BCH-178与抗体结合过程中疏水氨基酸和极性氨基酸的作用机制。方法定点突变分析技术分析BCH-178肽段上的疏水氨基酸(W218和W230),极性氨基酸(D229,R237和H238)和不带电氨基酸(Q236)的作用.用肽做包被抗原的ELISA分析E221-239肽,BCH-178肽和BCH-178肽的突变体与小鼠抗E1蛋白单抗的结合活性,用生物膜光干涉技术分析E221-239肽,BCH-178肽和BCH-178肽的突变体与小鼠抗E1蛋白单抗的结合动力学指标。用肽及其突变体与弗氏佐剂联用免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法检测BCH-178肽特异性的IgG抗体和灭活病毒特异性的IgG抗体,用T细胞增殖实验测定小鼠的细胞免疫水平。结果BCH-178肽上的R237H, H238R和R237A/H238A突变导致突变肽不能与抗E1单抗结合；W230F、W230A、W218A、Q236D、W218A/W230A突变降低突变肽与抗E1单抗的结合活性；W230Y和D229A突变提高突变肽与抗E1单抗的结合活性.W230F、W230A、W218A/W230A、D229A、Q236D、R237H,H238R、 R237A/H238A突变导致抗原肽的免疫原性丧失(针对BCH-178肽)；W230Y和W218A突变对抗原肽的免疫原性无影响(针对BCH-178肽)。W230F、W230A、 W218A、W218A/W230A、D229A、Q236D、R237H、H238R和R237A/H238A突变减低抗原肽引起的细胞免疫水平。结论237位和238位氨基酸是E1中和抗体表位中影响E1蛋白抗原性的关键氨基酸,其突变体丧失免疫原性和免疫反应性,230位,218位,229位和236位氨基酸的某些突变使抗原丧失了免疫原性,降低了抗原的免疫反应性,与E1蛋白的抗原特性密切相关。