柠檬烯是一种来源于植物的天然单萜类化合物,广泛应用于食品、制药、日用品、化妆品等行业。从植物中直接提取柠檬烯的传统方法虽然已经比较成熟,但同时也存在植物中产物含量低、提取纯化困难、原料供应受气候影响大等缺点。近年来,利用微生物细胞工厂合成各类植物天然化合物成为了研究热点。其中,解脂耶氏酵母天然具有广泛的碳源利用途径和高通量的乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A供应,因此成为将低值生物质转化为高附加值植物天然产物的优越微生物底盘。本实验室前期已经在解脂耶氏酵母底盘中构建了D-柠檬烯和L-柠檬烯的异源合成途径,但是依然存在亟待突破的瓶颈问题,如底盘耐受性不高、产物产量较低等。本研究首先利用代谢工程技术对解脂耶氏酵母中的异源柠檬烯合成途径进行了优化,从而提高了合成途径的代谢通量。随后,对所获高产工程菌株进行了碳源和辅助碳源等发酵条件的优化,既降低了培养成本,又提高了柠檬烯产量。最后,利用进化工程技术对工程菌株进行了实验室适应性进化,进一步提高了柠檬烯的产量,主要研究内容如下:（1）以橙花酯焦磷酸（NPP）为直接前体合成柠檬烯。本研究以过表达甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）和异源表达D/L-柠檬烯合成酶（D/L-LS）的解脂耶氏酵母Po1g DHR和Po1g LHR为出发菌株,异源表达来自番茄的截短橙花酯焦磷酸合酶（t NDPS1）,分别构建了能够以NPP为前体合成柠檬烯的工程菌株Po1g 1和Po1g 2,D-柠檬烯和L-柠檬烯产量分别达到了28.24 mg/L和27.60 mg/L。（2）内源甲羟戊酸（MVA）途径基因的组合过表达。为了提高柠檬烯合成途径的代谢通量,本研究进一步过表达了异戊烯基焦磷酸-δ-异构酶（IDI）,分别构建了工程菌株Po1g 3和Po1g 4,D-柠檬烯和L-柠檬烯产量分别达到了37.70 mg/L和36.74 mg/L。此外,在工程菌株Po1g 1-4的基础上,又对甲羟戊二酸单酰辅酶A合酶（HMGS）进行了过表达,分别构建了工程菌株Po1g 5-8。结果表明该途径酶的过表达并未引起目标产物产量的提高。（3）主要碳源的优化。对工程菌株Po1g 3和Po1g 4的主要培养碳源（葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜和厨房废油脂WCO）进行了优化,结果表明WCO是该工程菌株生产柠檬烯的最适发酵碳源,糖蜜次之。当以50 g/L WCO为碳源时,D-柠檬烯和L-柠檬烯产量分别达到了54.43 mg/L和55.56 mg/L。（4）辅助碳源的优化。本论文对工程菌株Po1g 3和Po1g 4的辅助碳源（丙酮酸、柠檬酸和醋酸）进行了优化,结果表明丙酮酸是工程菌株生产柠檬烯的最适辅助碳源。当以6 g/L丙酮酸为辅助碳源时,D-柠檬烯和L-柠檬烯产量分别达到了68.67 mg/L和67.32 mg/L。在上述最适发酵条件下,对工程菌株进行了5 d的摇瓶分批补料发酵优化。结果表明当WCO每日补料量为12 g/L时,D-柠檬烯和L-柠檬烯产量分别达到了105.34 mg/L和108.59 mg/L。（5）利用适应性进化工程同时提高工程菌株对柠檬烯的耐受性及产量。在柠檬烯浓度不断递增的培养基中,经过长达30 d的连续传代培养,最终获得了能够耐受高达2000 mg/L柠檬烯的进化菌株。这表明适应性进化工程能够有效提高解脂耶氏酵母工程菌株对柠檬烯的耐受性。在上述最适条件下,以WCO为碳源进行补料分批发酵后,D-柠檬烯和L-柠檬烯产量分别达到了120.13 mg/L和115.48 mg/L,与出发菌株Po1g DHR和Po1g LHR相比分别提高了47倍和41倍,这也是迄今为止解脂耶氏酵母摇瓶发酵生产柠檬烯的最高产量。总之,本研究通过代谢工程、进化工程以及发酵工程技术策略的结合使用,在以廉价WCO为碳源的培养条件下,成功提高了解脂耶氏酵母工程菌株积累柠檬烯的产量。本研究所获结果可为利用解脂耶氏酵母转化廉价碳源生产各种高附加值萜类产物提供思路与方向。