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云南素有“有色金属王国”的美誉,然而历史上矿产资源的无序开采导致矿区重金属污染严重,特别是土壤镉(Cd)污染已成为当地的重大环境问题。本实验室前期研究发现,会泽县者海镇镉(Cd)严重污染的铅锌矿区,常有深色有隔内生真菌(Dark septate endophyte, DSE)定殖于自然生长的植物根部,并且对重金属镉(Cd)表现出很强的耐性和抗性,DSE在促进植物适应重金属胁迫的矿区环境中很可能发挥着重要作用。因此研究DSE对镉的耐性及其相关机理,有利于阐明DSE在重金属严重污染的特殊生态系统中的功能地位,进而诠释Cd污染矿区DSE与植物重金属耐性的关系。Zip转运蛋白家族(Zinc regulating transport protein and iron regulating transport protein, Zip)是一类种类繁多、分布广泛、转运底物多样的跨膜转运器。已有的研究表明Zip转运家族与二价金属阳离子的转运有密切的联系,但是真菌中只有少数几个物种的Zip转运蛋白基因得到克隆并验证了功能,DSE中有关Zip家族基因的克隆和功能研究尚未见报道。本论文以分离自会泽铅锌矿区的嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila, ACCC32496,实验室编号为H93)为研究对象,利用454转录组高通量测序技术,对在无重金属Cd胁迫和Cd浓度为EC50的重金属胁迫条件下培养的H93菌株进行转录组测序,发现其中有41个基因功能注释为Zip基因家族相关基因,通过选取差异表达最为显著的comp6001基因(GenBank accession: KR270804)为目的基因,对其进行克隆、生物信息学分析、酵母异源互补功能验证、亚细胞定位和不同重金属胁迫条件下差异表达分析,得出以下结果：1. EpZip1基因的克隆与生物信息学分析采用反转录PCR技术克隆出comp6001基因的开放阅读框(ORF),将其命名为EpZip1,该ORF全长1578bp,可编码525个氨基酸,合成蛋白EpZIP1的分子量约为55.4kDa,等电点pI约为5.2。生物信息学分析结果表明组成该蛋白的氨基酸大部分为疏水性氨基酸,含有1个信号肽和Zip家族典型的8个跨膜结构域,预测表明其表达部位仅为细胞膜,可初步推断其为跨膜转运蛋白。系统进化分析表明该基因与其他不同来源的Zip基因家族成员有较高的同源性。2. EpZip1基因的功能验证采用酵母功能互补验证方法,将comp6001基因cDNA-ORF区(即EpZip1基因)融合到特异性表达质粒pFL61中,构建重组质粒。利用醋酸锂转化法,通过野生型酵母DY1457、铁缺陷型酵母DHY1453和锌缺陷型酵母ZHY3在特定筛选培养基上的生长状况,对EpZip1基因编码蛋白EpZIP1进行Zn、Fe转运功能验证。发现EpZip1基因的表达使得锌转运缺陷型酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)在低锌(EDTA螯合)培养基恢复生长,但转化的重组子酵母却在低铁(BPDS螯合)培养基无法生长。我们的结果表明EpZip1发挥部分或者完全的转运锌离子的功能,但不能吸收和转运二价铁离子。3. EpZipl基因亚细胞定位与表达分析通过构建含有comp6001基因cDNA-ORF区(即EpZip1基因)的重组pDDGFP-2质粒,使其在酿酒酵母ZHY3中诱导表达,荧光显微镜观察结果表明EpZip1基因所编码蛋白定位在细胞膜上。qRT-PCR研究结果表明,在重金属Cd2+、 Zn2+胁迫处理条件下,随着重金属浓度的升高,H93菌株中EpZip1基因分别呈现出了不同程度的下调表达趋势,EpZip1基因的表达受细胞外二价阳离子Cd2+、Zn2+浓度的调控。EpZip1基因编码蛋白EpZIP1在H93中可能起到将胞外二价阳离子吸收或转运到胞内的功能。