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目的:Eph/Efn Bs信号通路作为一条多环节、多作用位点的双向信号通路,可以调控肿瘤微血管形成、肿瘤微环境与免疫、肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等。课题组前期实验发现在皮肤鳞癌临床样本Efn B3异常升高。本课题的目的是进一步研究Efn B3在皮肤鳞癌组织及细胞系中的表达情况,分析其与皮肤鳞癌患者临床病理参数以及生存期的关系;探究Efn B3体内对DMBA/TPA诱导的皮肤癌的影响,体外对皮肤鳞癌细胞增殖迁移侵袭的作用;并对该进程中产生效应的机制进行探索,为预测皮肤鳞癌治疗寻找新的靶点及预后判断寻找新的生物标志物,旨在为皮肤鳞癌在基因治疗方面提供理论基础和实验依据。方法:第一部分:(1)通过q RT-PCR和Western Blotting分析Efn B3在几种鳞癌细胞中的表达;(2)从TCGA数据库下载头颈部鳞癌(HNSC)数据,对头颈部鳞癌中不同阶段病例的Efn B3表达量进行分析,再结合数据库中的临床信息,分析Efn B3表达水平与患者预后之间的相关性;(3)在野生型和Efn B3敲除基因型的ICR小鼠上建立DMBA/TPA诱导的鳞癌模型,评价Efn B3对于肿瘤发生和发展的影响;(4)在A431细胞系上采用si RNA沉默Efn B3;在Hacat细胞系上转染Efn B3高表达质粒;(5)CCK-8细胞增殖实验、流式检测细胞周期实验、Transwell迁移和侵袭实验研究Efn B3对A431细胞增殖和迁移侵袭的影响。第二部分:(1)结合TCGA临床数据库的信息,分析Efn B3与Notch1之间的关系;(2)通过q RT-PCR和Western Blotting从体内和体外验证Efn B3与Notch1通路之间的联系。第三部分:(1)采用无标记蛋白质组学技术分析Efn B3敲除基因型小鼠和野生型小鼠通过DMBA/TPA诱导的肿瘤之间的蛋白差异,利用Reactome数据库分析Efn B3调控蛋白,研究与Efn B3相关的通路;(2)Western Blotting验证质谱结果分析出的信号通路,并检测小鼠肿瘤组织内与肿瘤微环境相关的蛋白表达的变化;(3)在野生型和Efn B3敲除基因型的ICR小鼠上建立TPA急性致炎模型,评价Efn B3对于炎症的影响。结果:第一部分:在人表皮鳞癌细胞A431、人食管鳞癌细胞Eca-109、人鼻咽鳞癌细胞CNE中Efn B3的蛋白及m RNA表达均高于人永生化角质形成细胞Hacat;(2)分析TCGA数据库发现Efn B3的表达与头颈部鳞癌患者的TNM分期等临床特征具有显著性关系,随着T期等级越高,Efn B3的m RNA水平增加(p<0.05);不仅如此,高表达Efn B3的头颈部鳞癌患者具有更低的总生存率(p<0.05);(3)在DMBA/TPA模型中,Efn B3的缺失抑制了肿瘤的发生和发展;(4)在人表皮鳞癌细胞A431上转染Efn B3-si RNA,与阴性干扰组相比,Efn B3蛋白的水平明显降低(p<0.01);在人永生化角质形成细胞Hacat上转染Efn B3高表达质粒,与对照组相比,Efn B3蛋白的水平明显升高(p<0.01);(5)在人表皮鳞癌细胞A431上沉默Efn B3后,细胞增殖减慢(p<0.01),周期停滞在G1期(p<0.05),细胞迁移和侵袭能力均减弱(p<0.05)。第二部分:(1)TCGA数据库分析在头颈部鳞癌中,Notch1蛋白表达越高,Efn B3的m RNA的表达越高,说明Efn B3 m RNA与Notch1蛋白的表达呈正相关;(2)在人永生化角质形成细胞Hacat上高表达Efn B3会抑制NUMB蛋白的表达,增加Notch1核内蛋白NICD、转录因子RPBJ-k,下游靶标Hes-1和H-Ras蛋白表达,激活Notch1通路;在人表皮鳞癌细胞A431中干扰Efn B3会增加NUMB蛋白的表达,抑制Notch1胞内蛋白NICD、转录因子RPBJ-k,下游靶标Hes-1和H-Ras蛋白表达,抑制Notch1通路;在DMBA/TPA诱导的小鼠肿瘤中,缺失Efn B3会增加NUMB蛋白的表达,抑制Notch1胞内蛋白NICD、转录因子RPBJ-k,下游靶标Hes-1和H-Ras蛋白表达,抑制Notch1通路信号。第三部分:(1)通过四次生物学重复和定量分析共鉴定到了199个Efn B3的调控蛋白,其中123个蛋白表达下降,76个蛋白表达上升,并对这些调控蛋白进行生物学功能分析,通过Reactome数据库分析,我们发现Efn B3参与柠檬酸循环(TCA循环)、血小板脱颗粒、MAP2K和MAPK通路激活、翻译起始复合物的形成等生物功能,其中Fga、Fgb、Fgg、Iqgap1、Actb、Actg1这六个蛋白参与MAPK信号通路激活;(2)Western Blotting方法验证了在小鼠肿瘤中,缺失Efn B3导致MAPKs家族成员P-JNK(p<0.05)、P-p38(p<0.05)、P-ERK(p<0.05)蛋白表达显著下降,抑制了MAPK通路,这与质谱结果一致;不仅如此,我们得到在缺失Efn B3的小鼠肿瘤中,肿瘤微环境相关炎症蛋白COX-2、IL-1β、P-STAT3、p-65、P-p65、TNF-α表达均显著下降(p<0.05);(3)在TPA急性致炎模型中,缺失Efn B3抑制了P-STAT3、P-ERK、COX2的蛋白表达;降低了炎症导致的表皮增厚现象。结论:本研究表明Efn B3在人皮肤鳞癌组织中高表达,且高表达的Efn B3与患者较差的预后呈正相关,缺失Efn B3可以抑制肿瘤的发生和发展;干扰Efn B3能使细胞增殖减慢,还可减弱肿瘤细胞的侵袭和迁移能力;通过TCGA数据库和无标记蛋白质组学分析,Efn B3可能通过抑制NUMB的激活从而激活Notch1通路以及MAPK通路和相关炎症因子的释放促进肿瘤的发生和发展。