论文部分内容阅读
第一部分早期散发性结直肠癌全基因组甲基化谱特征分析目的:分析早期散发性结直肠癌肿瘤组织DNA、肿瘤患者粪便提取DNA及正常直肠粘膜组织DNA的全基因组甲基化谱特征。方法:利用全基因高通量芯片技术(Infmium 450K Methylation BeadChip甲基化芯片),分别对早期散发性结直肠癌肿瘤组织DNA、肿瘤患者粪便提取DNA及正常直肠粘膜组织DNA进行全基因组甲基化谱扫描。将芯片原始数据应用微阵列显著性分析软件(Significance Analysis of Microarrays,SAM)进行数据分析和筛选,初步构建早期散发性结直肠癌肿瘤组织DNA、肿瘤患者粪便提取DNA及正常直肠粘膜组织DNA的全基因组甲基化谱信息,并描述、对比其特征。结果:全基因组甲基化芯片原始数据通过微阵列显著性分析(SAM)分析、筛选,并结合生物分析软件(GO、KEGG等)进行基因聚类分析和基因生物学通路分析,最后发现早期散发性结直肠癌肿瘤组织DNA与肿瘤患者粪便提取其全基因组甲基化谱的DNA甲基化分布特征相似,它们与正常直肠粘膜组织全基因组甲基化谱的DNA甲基化分布情况存在显著差异。应用GO等生物分析软件富集分析发现有179个基因集在早期散发性结直肠癌组织DNA、肿瘤患者粪便提取DNA与正常直肠粘膜组织DNA之间存在差异。进一步通过KEGG等生物通路软件分析发现19个信号通路在早期散发性结直肠癌组织DNA、肿瘤患者粪便提取DNA与正常直肠粘膜组织DNA之间存在显著差异。结论:早期散发性结直肠癌组织DNA与肿瘤患者粪便提取DNA全基因组甲基化谱的DNA甲基化情况相似,这两者与正常直肠粘膜组织DNA全基因组甲基化谱的DNA甲基化情况存在差异。这些筛选出来异常的DNA甲基化位点可能对早期散发性结直肠癌的发生、发展起着重要作用,反映DNA甲基化是早期散发性结直肠癌的频发事件,说明早期散发性结直肠癌的发生发展是多个癌基因或抑癌基因共同作用的结果。第二部分 基于甲基化芯片的差异甲基化基因的筛选目的:通过对早期散发性结直肠癌肿瘤组织DNA、肿瘤患者粪便提取DNA及正常直肠粘膜组织DNA的全基因组甲基化谱的甲基化芯片的原始数据进行分析,结合多个生物信息软件的筛查,筛选出可能具有调控基因表达的DNA甲基化基因(功能性的DNA甲基化基团)。方法:将早期散发性结直肠癌肿瘤组织DNA、肿瘤患者粪便提取DNA及正常直肠粘膜组织DNA的全基因甲基化谱进行对比、分析,通过分析软件(SAM等)筛选具有差异表达的甲基化基因。将筛选出的具有差异表达的甲基化基因导入生物信息软件进行基因集聚、生物信号通路等分析,挖掘功能性的DNA甲基化基团。结果:通过生物信息软件基因集聚、生物信号通路等对早期散发性结直肠癌肿瘤组织DNA、肿瘤患者粪便提取DNA与正常直肠粘膜的全基因甲基化谱的分析,发现了 179个与正常直肠粘膜组织DNA全基因甲基化谱甲基化表达有显著差异。其中应用KEGG信号通路分析,发现这些甲基化差异表达的基因参与了 19个肿瘤相关的信号通路。结论:早期散发性结直肠癌的发生、发展过程中,可能多个肿瘤相关信号通路受DNA异常甲基化的调控影响,这些异常的DNA甲基化基因可能共同参与了早期散发性结直肠癌的发生、发展,反映出早期散发性结直肠癌的发生、发展是一个多信号通路共同参与的复杂性疾病,也揭示了早期散发性结直肠癌是一个多基因参与的疾病。这为进一步揭示早期散发性结直肠癌的分子生物学机制提供参考。第三部分 差异基因在肿瘤、粪便及正常组织中的甲基化差异及对早期散发性结直肠的诊断价值目的:检测、分析比较差异表达基因RP5在散发性结直肠癌肿瘤组织DNA、肿瘤患者粪便提取DNA及正常直肠粘膜组织DNA中的甲基化情况,并评价将其应用于早期散发性结直肠癌筛查、诊断的应用价值。方法:收集早期散发性结直肠癌肿瘤组织30例,结直肠癌患者粪便30例和正常直肠粘膜组织30例。应用巢式-甲基化特异性PCR(nMSP)结合琼脂糖凝胶电泳检验差异表达基因RP5在散发性结直肠癌肿瘤组织DNA、肿瘤患者粪便提取DNA及正常直肠粘膜组织DNA中的甲基化情况,并比较其差异,最后BSP法测序验证。本研究采用软件SPSS17.0做统计分析。如果是计量资料,则采用t检验;如果是计数资料,则采用x2分析。结果:经电泳发现,肿瘤组中30例样本,22例出现甲基化(73.3%),粪便组中30例样本,19例出现甲基化(63.3%),对照组中3例样本,2例出现甲基化(6.6%);经x2统计分析比较组间数据,比较显示差异表达基因RP5在肿瘤组中的甲基化频率(73.3%)明显高于对照组的甲基化频率(6.6%),两者差异有统计学意义(X2=29.584,P<0.001);粪便组中的甲基化频率(63.3%)明显高于对照组的基化频率(6.6%),两者差异有统计学意义(X2=21.582,P<0.001);而肿瘤组与粪便组的甲基化频率相比较,两者差异无统计学意义(X2=0.132,P>0.05)。结论:差异表达基因RP5在早期散发性结直肠癌肿瘤组织DNA和肿瘤患者粪便提取DNA中的甲基化频率明显高于正常直肠粘膜组织DNA的甲基化频率。差异表达基因RP5有可能成为早期散发性结直肠癌早期筛查、诊断价值的分子标志物。特别是对粪便提取DNA的检测有可能成为通过粪便DNA早期筛查、诊断早期散发性结直肠癌的一种无创性检测手段。