MicroRNAs(miRNAs)是非编码的小RNAs，在动物、植物和真菌的转录后基因调节中起重要的作用。目前，已知病毒也可产生miRNAs。为研究人乳头瘤病毒是否也可编码miRNAs，用生物信息学的方法预测HPV16基因组miRNA前体及其成熟的miRNAs。序列分析表明HPV16可编码一个pre-miRNAs。然后以pre-miRNAs推论出的成熟miRNA序列在3’UTR数据库中寻找靶基因。候选miRNA前体可被切割成推定的3个成熟的19-22碱基的miRNAs。通过在基因库内进行序列类比，结果发现很多候选的细胞和病毒的靶基因(如HPV16 L1)可不完全的结合这些病毒编码的vmiRNA序列，因此有可能潜在抑制这些基因mRNA的翻译。克隆HPV16vmi RNA的表达质粒，转染Hela细胞，实时定量PCR检测细胞中MycBP-2的表达水平的差异，结果表明HPV16 vmiRNA的表达可使Hela细胞内的mRNA水平下降2-3倍。这些数据表明HPV16编码的病毒miRNAs可能参与调节细胞和病毒自身的基因表达。本研究将为进一步实验验证HPV16 miRNAs的调节基因的作用奠定基础。小干涉RNA(small interfering RNA：siRNA)是一种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，诱导序列特异的目标基因的沉默，强大而迅速地阻断基因活性，可用于抑制癌蛋白表达的宫颈癌的基因治疗。为了构建HPV16E6癌基因特异的U6质粒表达质粒，合成不同序列的siRNA，并进一步优化其抑制HPV病毒癌基因表达及其对子宫颈癌细胞生长繁殖的效应，选择4个分别针对HPV16 E6 mRNA外显子和内含子序列为靶序列，合成DNA链，构建表达HPV16 E6短发卡样dsRNA的重组pSilencer1.0-U6载体，导入HPV-16 DNA阳性的宫颈癌细胞株CaSki中，观察该细胞中HPV-16 E6、E7基因表达水平及其蛋白含量的变化，并观察细胞生长被抑制的情况。结果发现四种HPV-16 E6 siRNA均能降低宫颈癌细胞CaSki的生长速率。通过细胞生长曲线观察到HPV16E6 shRNA表达质粒导入细胞0-96 h内，可降低细胞生长速度。荧光定量RT-PCR检测HPV16 E6 siRNA可使宫颈癌细胞株CaSki中HPV-16 E6、E7基因转录的mRNA水平降低，其中针对E6 mRNA内含子的重组shRNA只抑制E6基因的表达水平。Western blot分析表明4个HPV-16 E6 shRNA表达质粒转染HPV16相关宫颈癌细胞作用72hrs后，未能检测到宫颈癌细胞中HPV-16 E6蛋白。由此可见，HPV16E6 siRNA能使宫颈癌细胞CaSki生长缓慢；选择针对E6内含子的siRNA作用位点，特异性抑制E6表达；而针对E6外显子的siRNA作用位点，可抑制E6和E7基因的表达，是用于治疗HPV阳性宫颈癌细胞的理想靶位。骨形成是多种因子协同调节多种骨特异性基因表达的过程。骨发育相关基因的表达涉及复杂的信号分子网络，其中转录因子Cbfa1是一种关键的调节骨特异基因(如osteopontin和osteocalcin)表达的因子，在骨发育中发挥不可替代的调控作用。丧失Cbfa1的调节功能可引发骨质疏松症(osteoporosis)和骨硬化病(osteopetrosis)等代谢性骨病。成视网膜细胞瘤蛋白(Retinoblastomaprotein，pRb)被发现是Cbfa1诱导成骨细胞分化的共同活化因子，并且是介导骨发育所必需的。本研究组近期报道一种干扰素诱生蛋白p204与Cbfa1的调节功能相关，作为Cbfa1的共同活化因子可增强骨的形成。本研究进一步通过重组腺病毒Ad-p204hs编码反义p204 RNA抑制p204的表达后，多向分化潜能骨髓间充质干细胞系(pluripotent Mesenchymal stem cell line)C2C12丧失了Cbfa1对成骨细胞特异性基因的诱导活化，揭示在骨形成中p204的诱导表达是Cbfa1依赖性的基因活化表达所必需的。用多重蛋白免疫共沉淀和GST-pull-down实验揭示，p204，Rb和Cbfa1可形成三蛋白的复合体，Rb作为一个连接子分别结合p204和Cbfa1。而且通过染色质免疫沉淀实验(chromatin immunoprecipitation)在osteocalcin基因的启动子上可检测出该p204／Rb／Cbfa1转录复合物。缺失Rb结合位点的p204突变体失去了增强Cbfa1依赖性的转录活性和骨形成；另外，通过报告基因和体外骨发生实验表明，p204和Rb共同协同增强Cbfa1依赖的基因活化和成骨细胞分化，由此可见Rb是p204激活Cbfa1活性的作用所必需的。上述结果表明在BMP-2信号作用下，Rb和p204在Cbfa1介导的骨形成过程中起协同增强作用，p204／Rb／Cbfa1通过Rb作为连接桥形成一个复合物，从而发挥增强骨发育的生物学功能。在骨发育中，转录因子Cbfa1是由BMP-2诱导的一种关键的调节骨特异基因(如osteopontin和osteocalcin)表达的因子，在骨发育中发挥重要的调控作用。Ids蛋白也是一种BMP-2诱导蛋白，且抑制BMP-2诱导的成骨细胞分化，为常见的抑制细胞分化的因子。为揭示其分子机制，本研究研究Ids能否与Cbfa1相互作用并进一步抑制Cbfa1的生物功能。用免疫共沉淀和GST-pull-down实验揭示，Id2和Cbfa1可相互结合，Id2结合Cbfa1的区域位于HLH区，Cbfa1结合Id2的区域位于N端222-280的片段内。通过重组腺病毒Ade-Id2转导多向分化潜能骨髓间充质干细胞系(pluripotent Mesenchymal stem cell line)C2C12细胞，抑制了Cbfa1对成骨细胞特异性基因的诱导活化，并降低了该细胞内ALP活性及细胞分泌的OCL数量，揭示在骨形成中，Ids抑制Cbfa1的活性。而且通过chromatinimmunoprecipitation实验在osteocalcin基因的启动子上未能检测出该Id2蛋白或Cbfai蛋白或两者的复合物，揭示在骨形成中，Ids抑制Cbfa1的DNA结合活性。通过荧光免疫染色技术发现Id2蛋白在BMP-2诱导下，1H后在细胞内有表达蛋白存在，3H时由细胞核内向细胞核外转移，6H时细胞核内的Id2蛋白含量减少，大部分转移至细胞浆内。Western Blot实验结果表明Id2蛋白可使BMP-2诱导的C2C12细胞中的p204和Cbfa1水平下降。上述结果表明在BMP-2信号作用下，Id1，2，3在Cbfa1介导的骨形成过程中起抑制作用，Id2可与Cbfa1结合，从而抑制Cbfa1结合到osteopontin基因的启动子上；另外，Id2降低骨发育特异的转录因子Cbfa1和骨发育协同激活因子p204在骨发育早期的蛋白水平，从而抑制Cbfa1介导的骨发育过程。Id2是否通过由细胞核到细胞浆的转位，从而消除对Cbfa1转录活性的抑制作用有待进一步研究证实。在骨发育中，Ids蛋白可抑制转录因子Cbfa1调节骨特异基因(如osteopontin和osteocalcin)的表达，在骨发育中的早期发挥负调控作用。干扰素诱生蛋白p204可增强Cbfa1的调节功能，是增强骨形成的正调控因子。p204可与Ids蛋白相互作用，在肌细胞和心肌细胞发生过程中起作用。本研究的目的是研究p204能否克服Ids对成骨细胞分化的抑制及分子机制。用GST-pull-down实验和免疫共沉淀实验揭示，p204可与Id2和Cbfa1相互结合，并与Id2的亲和力较高。通过重组腺病毒Ade-p204和Ade-Id2转导多向分化潜能骨髓间充质干细胞系C2C12细胞，p204可克服Id2对Cbfa1诱导成骨活化的抑制作用，并增强了该细胞内ALP活性及细胞分泌的OCL数量，揭示在骨形成中，p204可克服Id2抑制Cbfa1活性的功能。而且通过chromatin immunoprecipitation实验揭示p204作用后，Cbfa1蛋白可重新结合osteocalcin基因的启动子，而当只有Id2蛋白时，Cbfa1蛋白则不能结合osteocalcin基因的启动子。p204可促进Id2蛋白从细胞核至细胞浆的转位并进一步降解，而p204的NES信号是此作用所必需的。上述结果表明在BMP-2信号作用下，p204通过(1)与Cbfa1蛋白竞争结合Id2蛋白，(2)促进Id2蛋自从细胞核至细胞浆的转位，(3)促进Id2蛋白降解，(4)去除Id2抑制Cbfa1结合DNA的作用，恢复Cbfa1对osteocalcin基因的启动子DNA的结合功能。从而克服Id2对Cbfa1介导的骨形成过程中的抑制作用，在骨发生的早期启动骨发育。综上所述，本研究内容涉及miRNA与siRNA在宫颈癌肿瘤细胞中的基因调控作用和骨发育过程中p204，Rb，Cbfa1，Ids四种蛋白之间的相互作用，研究结果如下：1．HPV16病毒可编码的病毒miRNA，该miRNA的编码序列位于HPV16基因组的L1基因3′UTR和LTR内，并参与调节细胞和病毒自身的基因表达。2．针对HPV16E6的siRNA能使宫颈癌细胞CaSki生长缓慢；选择针对E6内含子的siRNA作用位点，特异性抑制E6表达；而针对E6外显子的siRNA作用位点，可同时抑制E6和E7基因的表达，是用于治疗HPV阳性宫颈癌细胞的理想靶位。3．在BMP-2信号作用下，Rb和p204在骨发育特异的转录因子Cbfa1介导的成骨细胞形成过程中起协同增强作用，p204／Rb／Cbfa1通过Rb作为连接桥形成一个复合物，结合在骨成熟标志基因OCL的启动子DNA上。4．在BMP-2信号作用下，Id1，2，3在骨发育特异的转录因子Cbfa1介导的骨形成过程中起抑制作用，Id2可与Cbfa1结合，从而抑制Cbfa1结合到OCL基因的启动子上；另外，Id2降低Cbfa1和骨发育协同激活因子p204在骨发育早期的蛋白水平，从而抑制Cbfa1介导的骨发育过程。5．在BMP-2信号作用下，p204可克服Id2对Cbfa1介导的骨形成的抑制作用，在骨发生的早期启动骨发育。其机制为：p204通过(1)与Cbfa1蛋白竞争结合Id2蛋白，释放Cbfa1蛋白；(2)促进Id2蛋白从细胞核至细胞浆的转位，(3)促进Id2蛋白降解，(4)去除Id2抑制Cbfa1结合DNA的作用，恢复Cbfa1对OCL基因的启动子DNA的结合功能。