目的：热休克蛋白（Heat shock protein，Hsp）是一类在生物进化中高度保守、广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质，是生物细胞应激反应的诱导产物。其中Hsp70家族的分子伴侣参与多种生物学功能，包括蛋白折叠、蛋白转运、抑制和破坏蛋白聚集等。另外，越来越多的证据表明，Hsp70家族参与固有及获得性免疫应答，同时还具有潜在的免疫佐剂作用。　　 Hsp70L1为Hsp70家族的一个新成员，表达于树突状细胞、成纤维细胞等正常细胞及K562等多种肿瘤细胞。在DC上，Hsp70L1与Hsp70有相同的受体（CD91、TLR2/4），但与Hsp70不同的是，Hsp70L1可诱导DC产生IP-10，一种可使Th1极化的细胞因子，但Hsp70不能。而且，Hsp70L1比Hsp70使DC更容易表达IL-12p70，MIP-1，MIP-1，RANTES，CCR7，和CXCR4。　　 已有报道基因工程表达及纯化的Hsp70L1分子及其与抗原肽的融合蛋白不仅可以活化体外培养的DCs，甚至在动物体内也能显著地诱导出肿瘤特异性CTL和保护性的抗肿瘤免疫反应。因此，Hsp70L1具有很强的分子佐剂效应。　　 由于以“坏死”和“凋亡”不同死亡方式死亡的肿瘤细胞释放的HMGB1、Hsp70等“危险信号”不同，导致免疫系统对它们的应答结果不同，能以坏死的方式死亡的肿瘤细胞促进免疫细胞对死亡细胞的应答，而诱导凋亡的肿瘤细胞则会使宿主产生针对肿瘤抗原的免疫耐受。这一现象在近年的系列研究中受到热切的关注，并逐步阐明了坏死和凋亡过程中关键性的分子差别：HMGB1及Hsp70等“危险信号”分子。这些分子的发现及这些分子对免疫系统的刺激作用的结果，使得我们对“死亡”的肿瘤细胞对免疫系统的作用有了新的认识：死亡肿瘤细胞不再是一种被吞噬系统被动清除的“垃圾”，而是主动诱导免疫应答，也可能引起免疫抑制。另外，上述事实也提示我们，在利用“死亡“肿瘤负载DC制备DC疫苗时，应选择坏死而非凋亡的肿瘤细胞。作为Hsp70家族的新成员，Hsp70L1在“死亡”肿瘤细胞中对免疫系统的作用如何？如果Hsp70L1在肿瘤细胞的表达增加，对“死亡”肿瘤细胞的免疫原性影响如何？对这些问题的回答，有助于对Hsp70L1的免疫佐剂效应有新的认识。也为临床制备肿瘤细胞负载的DC疫苗的方法提供重要参考依据。　　 方法：　　 1、获得TRP2153.243及Hsp70L1基因　　 利用RT-PCR技术从小鼠黑色素瘤B16细胞中获得TRP2153-243及Hsp70L1基因。　　 2、获得TRP-HSP融合基因　　 将TRP2153.243及Hsp70L1的PCR产物分别用BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ内切酶进行双酶切，分别回收两个酶切片段，T4连接酶进行连接，得到该融合基因。　　 3、构建真核表达质粒pTRP2、pHsp701及pTRP2-HSP　　 将上述三种DNA片段连入真核表达载体pcDNA3.1，然后转化TOP10受体菌，经PCR及抽提质粒双酶切鉴定阳性克隆。抽提阳性克隆的质粒，进行测序。