随着恶性肿瘤发病率和死亡率逐年上升，传统的肿瘤治疗手段已经难以满足临床的需要。生物治疗作为肿瘤治疗的第四种模式，在恶性肿瘤的新兴疗法中独树一帜。治疗性肿瘤疫苗作为其重要组成部分，在临床上已显现乐观的前景。树突状细胞（dendritic cells，DC）治疗在肿瘤疫苗治疗中最具代表性。DC疫苗治疗的主要策略就是利用外源抗原的导入，使DC致敏，最终产生高效特异的抗肿瘤免疫反应。近年来，以DC为基础的肿瘤疫苗在各种恶性肿瘤治疗和预防的研究中进展迅速。现已证明，无论是单核细胞源性还是CD34⁺前体源性的DC，在临床中大量扩增都是可行的，并且DC免疫治疗的安全性和免疫原性也已得到了证实。但是这一疗法的临床有效率较低，怎样使DC疫苗最优化，从而最大限度地发挥免疫细胞的全部潜力，提高疫苗诱导的免疫反应强度是肿瘤基因疫苗能否最终应用于临床的关键。经过多年研究，多种细胞因子（cytokines）如白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等已先后用于肿瘤免疫治疗，但外源性细胞因子的应用受限于系统毒性和一过性效应等缺点。细胞因子基因转导的肿瘤细胞或免疫细胞可在肿瘤局部持续分泌内源性细胞因子，可以很好地克服上述缺点。但该技术的可行性以及抗肿瘤效应需要经过实验的证实。在维持或增强DC的功能方面，IL-12是具有最重要意义的细胞因子之一。在DC成熟的过程中，IL-12的产生使免疫反应向Thl方向发展。以IL-12基因转染DC，一方面通过外源表达IL-12来间接促进DC分化和成熟，另一方面成熟后的DC表达IL-12受体，促进分泌内源性IL-12，二者互相协同有利于肿瘤抗原递呈给T细胞，提高机体特异性抗肿瘤免疫功能。对于T细胞，IL-2、IL-7和IL-12是三种来源不同，但在功能上却相似的T细胞刺激因子，三者在体外均可刺激T细胞增殖，并且有促进抗肿瘤的CTL产生的作用。本课题研究选用具有独特优势的重组腺相关病毒（rAAV）作为载体，以人的癌胚抗原（CEA）基因作为肿瘤抗原基因，构建rAAV／CEA质粒，构建具有代表性的rAAV／cytokines(rAAV／IL-2、rAAV／IL-7、rAAV／IL-12和rAAV／IFN-γ质粒。将rAAV／CEA转染DC，并分别在DC上转染rAAV／IL-12，T细胞水平上转染rAAV／IL-2、rAAV／IL-7、rAAV／IL-12和rAAV／IFN-γ，获得了理想的表达效率。同时进行肿瘤细胞杀伤实验、免疫细胞增殖实验、特异性DC和CTL表面标志、CTL免疫表型、细胞内细胞因子水平和细胞形态学观察等研究，了解这些细胞因子基因的抗肿瘤及免疫调节反应作用，初步探讨其作用机理。从而为以rAAV为载体的DC免疫治疗探讨更有效的抗肿瘤免疫反应和临床应用方法。第一部分rAAV／IL-12转染DC对CTL的免疫调节作用材料和方法1．rAAV／CEA质粒的构建、包装和纯化：包括TRIzol法抽提总RNA、Oligotex mRNA Mini kit提取总mRNA、RT-PCR扩增、构建质粒、氯化钙转化法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞和双酶切鉴定质粒等方法。2．病毒滴度的测定：以地高辛标记的探针进行斑点杂交法测定。3．DC的产生以及rAAV的转染：外周单个核细胞（PBMC）和单核细胞的分离；成熟DC的诱导、rAAV／CEA和rAAV／IL-12病毒的转染。4．rAAV／CEA病毒转染DC的染色体整合、表达和效率：CEA的转录和表达、PCR／Southern blot分析、rAAV／CEA DNA染色体整合和rAAV／CEA转染效率的测定。5．混和淋巴细胞反应（Mixed lymphocyte reaction，MLR）6．CTL杀伤靶细胞实验：采用6小时⁵¹铬(⁵¹Cr)释放实验。7．rAAV／cytokines转染对细胞增殖能力的影响：磁珠分离法分离总T淋巴细胞后，³H掺入法检测。8．流式细胞仪分析细胞表型：成熟DC表面标志测定，在流式细胞仪（FACS）上检测CD14、CD80、CD86、CD83、CD40和HLA-DR的表达。9．激活的CTL免疫表型CD8／CD4和CD8／CD56测定：FACS双染色法测定。10．FACS检测细胞因子的表达：成熟DC的IL-12和IL-10的表达分析；激活CTL的IFN-γ表达分析。11．激活的CTL免疫表型CD8／CD69和CD4／CD25：磁珠分离法分离CD4⁺或CD8⁺T细胞后，进行FACS检测。12．酶联免疫吸附法（ELISA法）检测细胞因子的表达。结果1．质粒构建：构建rAAV／CEA和rAAV／IL-12质粒；经双酶切证明构建成功；并且病毒滴度可达到l×10¹¹eg／ml。2．rAAV／CEA和rAAV／IL-12转染DC的染色体整合、表达和效率：rAAV／CEA或rAAV／IL-12转染的DC中有相应的DNA整合；RT-PCR检测表明，CEA和IL-12亚基p40在DC内成功表达；FACS分析表明，rAAV／CEA高效率转染DC，其蛋白在DC内成功表达。3．CTL对靶细胞杀伤实验：rAAV／CEA病毒转染的DC激活CTL，其杀伤活性具有靶抗原特异性和MHCⅠ类限制性；rAAV／IL-12能够上调这种杀伤活性。4．DC表面标志：rAAV／CEA病毒转染DC，可明显上调CD40，CD80，CD83和CD86分子的表达水平，下调CD14分子的表达水平，从而增强DC的生物活性功能。而且同时转染rAAV／IL-12病毒，即增强内源性具有活性的IL-12的表达水平，能够明显进一步上调CD40，CD80和CD83分子的表达水平，下调CD14分子的表达水平，更进一步增强DC功能。5．对T淋巴细胞增殖能力的作用：rAAV／CEA转染促进淋巴细胞的增殖反应，rAAV／CEA＋rAAV／IL-12共转染能够进一步上调这种增殖反应。6．在DC中IL-12和IL-10的变化情况：rAAV／CEA转染DC可明显升高具有生物活性的IL-12分泌，降低IL-10分泌；rAAV／CEA＋rAAV／IL-12转染能够进一步上调这种促进分泌的作用。rAAV／CEA＋rAAV／IL-12转染DC较rAAV／CEA＋exoIL-12转染有更高的IL-12和更低的IL-10水平，提示内源性IL-12较外源性IL-12效果好。7．DC激活T细胞的免疫表型①CD8／CD4 T细胞亚群的分析：CD4⁺T细胞水平无明显差异。rAAV／CEA病毒转染DC后激活的CTL，能够上调被刺激的CD8⁺T细胞亚群水平；而rAAV／CEA⁺rAAV／IL-12共转染时，能够进一步上调CD8⁺T细胞亚群水平。②CD8／CD56的比例分析：rAAV／CEA病毒转染的DC可能选择性地刺激CTL，而非NK细胞；而且该DC同时共转染rAAV／IL-12病毒时，能够增强刺激CTL的反应，降低对NK细胞的激活。③CD8⁺细胞中CD69⁺细胞分析：rAAV／CEA病毒转染DC后激活的CTL，能够明显提高激活的CD69⁺CD8⁺T细胞亚群数量；与rAAV／IL-12病毒共转染DC后，能够进一步提高此细胞亚群数量，即具有活性的CTL细胞数量。④CD4⁺细胞中CD25⁺细胞分析：rAAV／IL-12病毒转染DC后激活的CTL，能够明显降低CD25⁺CD4⁺T细胞亚群数量，即降低抑制性T细胞亚群数量及其生物活性。而rAAV／IL-12＋rAAV／CEA共转染时，能够进一步上调上述作用。8．激活CTL的细胞因子表达：rAAV／CEA病毒转染的DC能够明显上调T细胞的IFN-γ表达水平；与rAAV／IL-12病毒共转染DC后，能够进一步上调T细胞的IFN-γ表达水平，从而促进CTL的杀伤活性。结论1．以rAAV为载体介导CEA基因转染DC，能够诱导特异CTL治疗CEA阳性恶性肿瘤；2．rAAV／IL-12能够增强rAAV／CEA诱导特异性CTL的免疫调节作用，说明可考虑在以抗原诱导rAAV的基础上，加入细胞因子基因介导。第二部分rAAV介导的细胞因子基因转染淋巴细胞对CTL活性的调节作用材料和方法1．rAAV／cytokines(rAAV／IL-2、rAAV／IL-7、rAAV／IL-12和rAAV／IFN-γ质粒的构建、包装和纯化：包括TRIzol法抽提总RNA、Oligotex mRNA Mini kit提取总mRNA、RT-PCR扩增、构建质粒、氯化钙转化法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞和双酶切鉴定质粒等方法。2．病毒滴度的测定：以地高辛标记的探针进行斑点杂交法测定。3．rAAV／cytokines的转染不同培养时间的PBL。4．rAAV／cytokines病毒转染PBL的染色体整合、表达和效率：细胞因子的转录和表达、PCR／Southern blot分析、rAAV／cytokines DNA染色体整合和rAAV／cytokines转染效率的测定。5．混和淋巴细胞反应（MLR）。6．CTL杀伤靶细胞实验：采用6小时⁵¹铬(⁵¹Cr)释放实验。7．rAAV／cytokines转染对细胞增殖能力的影响：磁珠分离法分离总T淋巴细胞后，³H掺入法检测。8．激活的CTL免疫表型CD8／CD4和CD8／CD56测定：FACS双染色法测定。9．FACS检测细胞因子的表达：成熟DC中IL-12和IL-10的表达分析；激活CTL的IFN-γ表达分析。10．激活的CTL免疫表型CD8／CD69和CD4／CD25：磁珠分离法分离CD4⁺或CD8⁺T细胞后，FACS测定。11．ELISA法检测细胞因子的表达。结果1．质粒构建：构建rAAV／IL-2、rAAV／IL-7、rAAV／IL-12和rAAV／IFN-γ质粒；经双酶切证明构建成功；并且病毒滴度可达到1×10¹¹eg／ml。2．rAAV／cytokines转染DC的染色体整合、表达和效率：rAAV／cytokines转染的PBL中有相应的DNA整合；RT-PCR检测表明，rAAV／cytokines均表达相应的细胞因子mRNA；FACS分析表明，rAAV／cytokines高效率转染PBL，其蛋白在PBL内成功表达；ELISA检测表明，rAAV／cytokines转染的PBL能够表达相应的细胞因子，并且以转染后80小时的水平最高。3．CTL对靶细胞杀伤实验：rAAV／IL-7、rAAV／IL-12和rAAV／IFN-γ转染PBL能够增强rAAV／CEA转染DC激活的CTL的杀伤作用，而且PBL培养第5天转染（D5）的rAAV／IL-7转染组、D5 rAAV／IFN-γ转染组和D3 rAAV／IL-12转染组的效果最好。rAAV／IL-2无此作用。4．对T淋巴细胞增殖能力的作用：早期转染（D3） rAAV／IL-2可能有助于T淋巴细胞的增殖，而晚期转染（D5）则相反。晚期转染（D5）rAAV／IL-7可能有助于T淋巴细胞的增殖。早期转染（D3）rAAV／IL-12转染组对T淋巴细胞增殖起促进作用。rAAV／IFN-γ转染对T淋巴细胞的增殖无影响或是具有抑制作用。5．DC激活的T细胞中免疫表型①CD8／CD4：rAAV／IL-2可能对被rAAV／CEA转染的DC所刺激的CD8⁺T细胞的增殖具有抑制作用。在PBL培养至第5天时，进行rAAV／IL-7转染能够明显增强CD8⁺T细胞的增殖反应；在第3天时，能够促进CD4⁺T细胞的增殖反应。rAAV／IL-12作用的靶细胞为CD8⁺T淋巴细胞，而非CD4⁺T淋巴细胞；且早期转染，即在PBL培养至第3天时能够有效地促进rAAV／CEA转染DC所刺激的CD8⁺T细胞的增殖反应，对CD4⁺T细胞作用不明显。在PBL培养至第5天时进行rAAV／IFN-γ转染，能够明显提高CD8⁺T细胞数量，还有可能降低CD4⁺T淋巴细胞的增殖反应，进而增强CTL的生物功能；而早期转染却无此作用。②CDg／CD56：rAAV／Cytokines不会促进CD56⁺细胞及NK细胞的增殖反应，而且在晚期转染即PBL培养至第5天时进行rAAV／IL-12或rAAV／IFN-γ转染，有可能选择性地促进CTL的增殖反应，并抑制NK细胞的增殖反应或活性的明显上调。③CD69／CD8：除rAAV／IL-2病毒外，其它病毒均具有上调CD69⁺CD8⁺T细胞数量的生物活性作用，其中在PBL培养至第3天时进行rAAV／IL-12转染，第5天时进行rAAV／IL-7或rAAV／IFN-γ转染，上调CD69⁺CD8⁺T细胞数量非常显著。④CD25／CD4：除rAAV／IL-2转染组外，其它转染组未明显增加CD25⁺CD4⁺T淋巴细胞数量，即未明显增强抑制性T淋巴细胞的增殖反应，并有可能未上调其生物活性功能，从而增强rAAV／CEA转染的DC所激活的CTL的杀伤靶细胞的作用。6．激活CTL的细胞因子表达：rAAV／IL-2转染组较对照组的IFN-γ水平明显低下。D3 rAAV／IL-12转染组，D5 rAAV／IL-7转染组以及D5 rAAV／IFN-γ转染组的IFN-γ水平明显升高。结论rAAV／IL-7、rAAV／IL-12和rAAV／IFN-γ能够有效地增强CTL的抗肿瘤反应，而且不同细胞因子基因在不同时间的作用不一致。虽然利用rAAV／IL-2未取理想的增强抗肿瘤反应作用，但是在激活CTL培养过程中，仍可考虑替代外源性IL-2。全文结论1．在基础试验中已经证实，以rAAV／CEA转染DC疫苗，能够诱导抗肿瘤活性。2．rAAV／IL-12病毒能够增强以抗原基因负荷病毒转染DC疫苗的抗肿瘤活性，值得进行进一步研究和探讨。3．与外源性细胞因子相比较，rAAV／IL-7、rAAV／IL-12和rAAV／IFN-γ病毒能够有效地增强CTL的抗肿瘤反应，而且不同细胞因子基因在不同时间的作用不一致。4．虽然利用rAAV／IL-2未取得理想的增强抗肿瘤反应作用，但是在今后的研究中值得进一步深入研究。