第一部分 应用基因芯片技术分析先天性巨结肠相关基因一、目的：通过应用全基因组表达谱芯片技术检测人类先天性巨结肠(Hirschsprung disease, HD)病变肠管组织与自身正常肠管组织的基因表达情况,获得差异基因表达谱,对差异显著的热点基因进行生物信息学分析,得出可能与先天性巨结肠发病机制相关的基因及信号通路,分析其在先天性巨结肠发生发展过程中的可能作用,为先天性巨结肠相关基因的进一步功能研究提供基础数据；期望通过全面了解先天性巨结肠基因表达情况,发现病变组织与正常组织的差异表达基因,筛选出先天性巨结肠相关基因,为进一步揭示先天性巨结肠的发病机制及寻找巨结肠相关生物标记物提供线索及理论依据。二、方法：1、选取自2015年01月至2015年06月期间广东省妇幼保健院/广东省儿童医院新生儿外科收治的确诊为先天性巨结肠并接受一期根治手术的病例8例,取其手术切除并经病理证实的先天性巨结肠病变肠管组织和切缘正常肠管组织标本各8份作为芯片检测和验证对象。2、基因芯片检测采用Agilent公司定制的包含60110条探针的人类全基因组表达谱芯片,检测8对先天性巨结肠病变肠管组织及切缘正常肠管组织的基因表达情况。提取各组织标本总RNA并纯化mRNA,逆转录后分别使用Cy5、Cy3标记,表达谱芯片杂交并扫描获取荧光信号,用芯片数据分析软件对扫描结果进行分析,获得8对标本的基因表达谱数据。应用差异表达基因聚类分析和芯片差异显著性分析(Significance Analysis of Microarray, SAM)软件对有表达的基因进行差异表达分析,筛选获得先天性巨结肠病变组织与正常组织的差异表达基因。3、生物信息学分析对差异表达基因进行生物信息学分析,根据基因功能分类体系(Gene ontology, GO)中生物学过程、细胞组成和分子功能三个部分对得出的差异表达基因进行功能富集分析,并通过查询KEGG等相关数据库进行通路分析,得出可能与先天性巨结肠发病机制相关的基因及信号通路。通过文献检索,对感兴趣的可能与先天性巨结肠发生的生物学过程关系密切的基因及信号通路进行分析,初步探讨相关的基因及信号通路在先天性巨结肠发生中的可能作用机制。4、定量PCR及免疫组化验证采用反转录荧光定量PCR (RT-qPCR)及免疫组化技术对筛选出的可能与先天性巨结肠发生的生物学过程关系密切的基因及信号通路的热点相关基因在HD病变组织和正常组织中的表达产物进行检测,验证芯片结果的准确性。三、结果：1、基因芯片检测结果通过对芯片杂交扫描结果进行数据分析,筛选出有表达意义的基因11949个(其中蛋白编码基因9659个)。应用芯片差异显著性分析(SAM)软件,按差异倍数值>2.0倍或<0.5倍,q-value<0.05为差异显著性标准,对有表达的基因进行差异表达分析,筛选出先天性巨结肠病变组织和正常组织的差异表达基因共253个,其中在病变组织中下调基因有213个(211个显著,其中46个1ncRNA),占84.19%;上调基因40个(31个显著,其中3个lncRNA),占15.81%。获得先天性巨结肠病变组织与正常组织差异基因表达谱。聚类分析显示,先天性巨结肠病变组织的基因表达总体是较正常组织下调的,整体呈现退行性表达。2、生物信息学分析将这些差异表达基因分别按GO的生物学过程、细胞组成和分子功能进行富集分析,发现多个重要基因功能的富集,涉及肌肉收缩、肌肉系统过程、G蛋白偶联受体信号通路、离子转运、神经肽信号通路、平滑肌收缩、钙离子转运、神经系统过程、细胞表面受体相关信号通路、突触传导等重要生物学过程或信号通路；将差异表达基因通过查询KEGG等相关数据库进行通路分析,发现数个重要通路的富集,涉及血管平滑肌收缩、钙离子信号通路、神经活性配体受体相互作用等通路。GO生物学过程分类中神经元分化调控和神经元投射发育调控这两个通路可能与先天性巨结肠发病过程中ENCC的迁移、增殖和分化关系较为密切,两者功能相近且差异基因有重叠,我们将之合并为神经元分化及投射相关信号通路作为进一步研究的对象。芯片结果显示,神经元分化及投射相关信号通路里的5个基因(PH0X2B, TLX2, CDH2, TNFRSF12A, NEFL)均表达显著差异,差异表达倍数分别为0.15,0.34,0.45,2.01,0.25。通过文献检索,已有研究显示PH0X2B,TLX2,CDH2与先天性巨结肠发病机制有关,这进一步支持了芯片检测的结果;而TNFRSF12A, NEFL系首次发现的先天性巨结肠相关基因。3、芯片结果的验证为了验证神经元分化及投射相关信号通路的基因在先天性巨结肠病变组织和正常组织中是否差异表达,同时也为了验证芯片结果的有效性和准确性,我们选取了神经元分化及投射相关信号通路的3个基因(CDH2, TNFRSF12A, NEFL)作为验证对象(由于已有报道显示PH0X2B, TLX2, CDH2与先天性巨结肠发病机制有关,故仅选取其一CHD2作为验证对象；而TNFRSF12A, NEFL系首次发现的先天性巨结肠相关基因),对8对先天性巨结肠病变组织和正常组织进行RT-qPCR检测。结果显示,CDH2在病变组织中mRNA表达量较正常组织明显下调,平均下调4.6倍(芯片结果2.2倍)；TNFRSF12A在病变组织中mRNA表达量较正常组织明显上调,平均上调2.3倍(芯片结果2.01倍)；NEFL在病变组织中mRNA表达量较正常组织明显下调,平均下调14.9倍(芯片结果4倍)。RT-qPCR验证结果与芯片结果一致。应用免疫组化技术对上述3个基因(CDH2, TNFRSF12A, NEFL)在先天性巨结肠病变组织和正常组织中的蛋白表达进行验证,结果显示CDH2在病变组织肌间神经纤维中呈阴性表达,而在正常组织肌间神经丛中呈中阳性表达;TNFRSF12A在病变组织肌间神经纤维中呈强阳性表达,而在正常组织肌间神经丛呈弱阳性表达;NEFL在病变组织肌间神经纤维中呈弱阳性表达,而在正常组织肌间神经丛中呈强阳性表达。免疫组化结果与RT-qPCR和芯片结果基本一致。四、结论1、利用全基因组表达谱芯片研究先天性巨结肠的基因表达变化,发现先天性巨结肠病变肠管组织与正常肠管组织间在基因的表达层面存在明显差异,病变组织的基因表达总体是较正常组织下调的,整体呈现退行性表达。筛选得到的基因及信号通路可能与先天性巨结肠的发生发展密切相关,可能在先天性巨结肠发生发展过程中具有重要生物学功能；这需要进行更深入的分子水平研究,以进一步探讨其在先天性巨结肠发生发展过程中的具体作用机制。2、神经元分化及投射相关信号通路的基因表达在先天性巨结肠病变组织中明显异常,其中PHOX2B,TLX2,CDH2已有报道显示与先天性巨结肠发病机制有关,而TNFRSF12A, NEFL系首次发现的先天性巨结肠相关基因,并利用常规分子生物学技术从mRNA和蛋白水平得到验证,表明该信号通路可能参与先天性巨结肠的发生发展过程。3、基因芯片是一种高通量分析方法,可高效、可靠地筛选先天性巨结肠病变组织与正常组织的差异表达基因,是了解先天性巨结肠相关基因的有效工具。本研究筛选得到的先天性巨结肠相关基因和信号通路,为进一步揭示先天性巨结肠发病机制并为寻找巨结肠相关生物标记物和探索潜在针对性干预措施提供了理论基础和线索。第二部分 基于CMAP数据库筛选先天性巨结肠潜在干预分子一、目的利用先天性巨结肠病变肠管组织与自身正常肠管组织的差异基因表达谱数据,通过关联性图谱(Connectivity Map, CMAP)数据库和生物信息学方法,筛选对先天性巨结肠基因表达具有反向作用的负相关小分子化合物,期望寻找出潜在的有望在将来用于干预先天性巨结肠发生发展及其治疗的化学物,从而开辟出治疗先天性巨结肠的新方法。二、方法1、将先天性巨结肠病变肠管组织与自身正常肠管组织的差异基因表达谱建立成Query Signature格式文件后,登录CMAP数据库网站,检索得出与先天性巨结肠相关的化合物。2、对关联度最大的几种负相关的小分子化合物进行文献检索,筛选出有意义的、可能与先天性巨结肠发病机制有关的负相关小分子化合物,分析其在预防先天性巨结肠的发生发展以及治疗中的可能作用机制。三、结果1、通过CMAP数据库筛选出关联度最大的十种负相关的小分子化合物,按照负性富集关联系数由高到低依次为：HC-toxin、Phenacetin、Etifenin、5666823、PHA-00665752、Tubocurarine chloride、 AH-6809、Monobenzone、Fenspiride、 Selegiline,它们是对先天性巨结肠基因表达具有反向作用的干预分子。2、经过文献检索,这些小分子化合物的主要作用机理是：HC-toxin是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,可诱导神经母细胞的分化。Phenacetin,中文名非那西汀,学名为对乙酰氨基苯乙醚,是乙酰苯胺类解热镇痛剂。Etifinin,中文名依替菲宁,化学名N-(2,6-二乙基苯胺基甲酰甲基)亚氨基二乙酸,可作为肝胆显影剂。5666823是一种尚未命名的小分子化合物,对线虫有促进神经再生的作用。PHA-00665752是c-Met抑制剂,常用于肿瘤的药物研究。Tubocurarine Chloride,中文名氯化筒箭毒碱,是一种非去极化型肌松药。AH6809是一种特异的前列腺素E2受体拮抗剂。Monobenzone,中文名莫诺苯宗,学名对苄氧基苯酚,是一种局部使用的脱色剂。Fenspiride,中文名芬司匹利,是一种α-肾上腺素受体阻滞剂。Selegiline,中文名司来吉兰,是一种单胺氧化酶B抑制剂,具有神经保护作用。3、文献检索结果显示,组蛋白去乙酰化酶抑制剂HC-toxin有诱导神经分化的作用,单胺氧化酶B抑制剂Selegiline具有神经保护作用,表明HC-toxin和Selegiline是对于先天性巨结肠病变组织中神经分化／保护信号通路异常的基因表达具有逆转作用的干预分子,而这些作用机制与先天性巨结肠发生的生物学过程关系较为密切,推测这两种化合物最有潜力发展为治疗HD的药物。四、结论1、 HC-toxin和Selegiline是对于先天性巨结肠基因表达具有反向作用的干预分子,可能在先天性巨结肠发病过程中具有神经细胞分化及保护作用并逆转先天性巨结肠异常的基因表达,揭示这些化合物有潜在应用于先天性巨结肠防治的前景。2、CMAP数据库可作为预测疾病预防和治疗的潜在干预分子的有效工具。基于表达谱芯片数据及CMAP数据库筛选出的先天性巨结肠潜在干预分子为将来进一步开辟治疗先天性巨结肠的新方法提供理论基础。