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研究背景与目的:骨肉瘤(osteosarcoma)是骨骼中最常见的恶性肿瘤之一,主要在儿童和青少年中多发,占儿科患者中所有恶性肿瘤的2.4%,男性比女性发病率略高。骨肉瘤通常起源于四肢长骨,常见部位包括股骨远端(30%),胫骨近端(15%),以及肱骨近端(15%)。骨肉瘤的标准治疗方法是术前辅助化疗,手术切除和术后放疗,化疗等辅助治疗。这种综合治疗策略虽然改善了局部骨肉瘤患者的预后,但是对于转移性和复发性骨肉瘤患者,他们的预后仍然较差。热休克因子1(Heat shock factor 1,HSF1)是由hsf1基因编码的蛋白质。HSF1在真核生物中高度保守,是应激转录反应的主要介质,在非应激调节如发育和代谢中起重要作用。HSF1蛋白是热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)的主要转录因子,在调节人体的热休克反应(Heat shock response,HSR)中起重要作用。热休克反应通过调节控制细胞内蛋白质的正确折叠和分布起到保护作用。HSF1还可以反式激活许多参与DNA损伤修复和新陈代谢的蛋白质的基因,这表明HSF1不仅在热休克反应中,而且在衰老和疾病中发挥重要作用。近年来的研究显示HSF1在恶性肿瘤中被激活和高表达,并且HSF1的高表达已经证明与多种实体瘤的预后不良相关。因此,研究HSF1在肿瘤中的表达情况对于肿瘤的治疗和预后具有重要的临床意义,但HSF1在骨肉瘤中的表达情况及与预后的相关性尚未被研究。蛋白激酶A(PKA)在涉及细胞生长,增殖,代谢和疾病的信号转导途径的很多方面中起重要作用。PKA是细胞代谢和基因转录的重要调节因子,可以与多种蛋白质底物相互作用,使其在丝氨酸或苏氨酸残基上发生磷酸化调节。PKA功能的研究的主要方法是使用药理学抑制剂。其中之一,H89,是一种强大的特异性的PKA抑制剂,具有容易穿过细胞膜的能力和体外、体内的临床前活性。前期的研究表明,HSF1蛋白在形成三聚体之后,要经过磷酸化调节介导其入核和发挥转录功能,而PKA对HSF1蛋白的320位丝氨酸(S320)的磷酸化调节,对于HSF1的入核和转录功能有重要的意义。在骨肉瘤细胞中,S320的磷酸化调节对于HSF1的核转位和转录功能的作用尚不清楚。研究的主要目的:明确HSF1在骨肉瘤样本中的表达及与患者预后的关系,从细胞和动物水平,研究HSF1对骨肉瘤生物学行为的影响,并进一步探究其作用机制,为寻找骨肉瘤预后相关生物标志物和可能的治疗靶点提供新思路。研究方法:1、选取在本科室进行手术的骨肉瘤患者肿瘤组织和瘤旁组织样本共20对,通过qRT-PCR和组织芯片检测骨肉瘤组织和瘤旁组织样本中HSF1的表达,进而对65例骨肉瘤组织进行免疫组化评分,联合患者的临床资料进行Log-rank单因素分析及COX多因素分析,评价HSF1与骨肉瘤患者临床预后的相关性。2、以MNNG和U-2OS两种骨肉瘤细胞系为靶细胞,利用慢病毒和siRNA调控HSF1的表达,并通过增殖,迁移和侵袭等细胞功能实验检测HSF1对骨肉瘤细胞生物学行为的影响,检测HSF1敲低对骨肉瘤细胞凋亡和细胞周期的影响,并利用裸鼠皮下成瘤实验验证HSF1的效应。3、探索HSF1影响骨肉瘤生物学行为的机制,我们以磷酸激酶A(PKA)的小分子抑制剂H89为工具药,干预HSF1的磷酸化调控(S320),通过蛋白质印迹实验和免疫荧光染色检测磷酸化S320 HSF1蛋白表达水平和HSF1的核转位情况;进一步以U2OS细胞系为靶细胞,通过CRISPR/CAS9技术构建介导HSF1入核的磷酸化重要位点(S320)的突变株,研究抑制HSF1核转位对骨肉瘤细胞恶性生物学行为的影响;并通过表达谱测序分析HSF1影响骨肉瘤生物学行为的主要信号通路及下游基因。实验结果:1、通过qRT-PCR和组织芯片免疫组化(IHC)染色,发现HSF1的mRNA和蛋白表达在骨肉瘤组织中较癌旁组织显著升高,并且HSF1蛋白主要在细胞核内表达。进一步扩大样本量,对65例骨肉瘤组织的HSF1免疫组化染色结果进行评分,分为高表达和低表达组,发现HSF1高表达组,肿瘤直径更大,术后复发及转移几率升高。2、通过调控MNNG和U2OS骨肉瘤细胞系中HSF1的表达,发现上调HSF1表达可以明显地促进骨肉瘤细胞的增殖,迁移和侵袭,而下调HSF1表达结果相反,并可以促进细胞凋亡;调控HSF1的表达对肿瘤细胞成球实验无明显影响;通过裸鼠皮下成瘤实验,进一步明确了HSF1过表达能够明显促进骨肉瘤成瘤和骨肉瘤的生长。3、通过IHC和蛋白质印迹发现骨肉瘤组织较瘤旁组织中S320磷酸化的HSF1表达明显升高;接着利用H89处理骨肉瘤细胞,蛋白质印迹实验和免疫荧光染色提示,S320磷酸化的HSF1蛋白表达降低,HSF1的核定位减少;构建S320A突变细胞系,细胞功能实验提示单用H89处理或者S320A突变均能显著抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力,促进骨肉瘤细胞的凋亡;通过S320A突变U2OS细胞和野生型U2OS细胞系的表达谱测序发现,S320A突变后,出现差异表达的基因主要富集在与细胞粘附和EMT相关的通路上,与肿瘤细胞粘附和EMT相关的基因,如Vimentin,Mmp2,Snail1,Smad2,KRT14和Mmp9等表达显著降低。结论:基于以上研究结果,我们认为HSF1的高表达预示着临床预后不良;HSF1可以增强骨肉瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,并且减少骨肉瘤细胞的凋亡,从而促进骨肉瘤的发展和转移;S320的磷酸化是调控HSF1促瘤作用的重要位点,可能是未来研究骨肉瘤药物治疗的重要靶标。