研究背景与目的肾母细胞瘤又称肾胚胎瘤。1899年Max Wilms医生首先对其做了详细的描述,故又称Wilms瘤(Wilms tumor)。肾母细胞瘤是儿童最常见的原发于肾脏的恶性肿瘤。在过去的几十年中通过手术、化疗和放疗的综合治疗肾母细胞瘤的预后较以往有了很大的改善,长期生存率明显提高。但对于间变型、双侧肾母细胞瘤和转移复发者,尽管通过长春新碱(Vincristine,VCR)、放线菌素D、阿霉素、环磷酰胺等药物的长期化疗,患儿生存率仍然较低且易出现严重的化疗副作用。长春新碱是肾母细胞瘤的一线化疗药物,但是长春新碱在化疗过程中容易产生肿瘤多药耐药现象,导致化疗疗效降低。而且长春新碱对骨髓的抑制程度、神经系统的刺激性以及注射局部正常组织的刺激性较大,限制了其临床应用范围和剂量的增加,限制了疗效的提高,尤其是对于高危肾母细胞瘤患儿,常常需要大剂量化疗和联合化疗,有时会出现严重的化疗副作用。如何降低化疗强度,减少化疗剂量及化疗时间进而减少化疗的毒副作用,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性以改善化疗效果进而提高患儿的生存率是目前肾母细胞瘤的重要研究方向。因此迫切需要寻找新的化疗药物或联合用药方案以提高化疗效果并减轻化疗的毒副作用。目前临床上往往采用联合用药的方法降低长春新碱的毒性并提高其疗效。近年来研究倾向于寻找具有抗肿瘤活性的化合物或临床药物与长春新碱联合应用,以便在不增加细胞毒性的基础上,增加肿瘤细胞对长春新碱的敏感性。穿心莲内酯(Andrographolide,AND)是从中药穿心莲中提取出来的最具活性的成分。近年来研究发现穿心莲内酯除了具有抗炎、抗病毒和免疫调节等作用以外,在抗肿瘤方面也具有良好的生物活性,它对胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞均具有较强的生长抑制作用。穿心莲内酯主要通过两种途径抑制肿瘤细胞的生长,一是通过激活促凋亡的JNK通路、抑制抗凋亡的PI3K/AKT和ERK通路、激活ERK-p53凋亡通路或经Caspase依赖性凋亡引起凋亡性细胞死亡,二是通过细胞周期阻滞抑制细胞生长。此外还有研究发现穿心莲内酯能增加卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性。但至今为止鲜有研究报道穿心莲内酯对肾母细胞瘤的抗肿瘤作用。穿心莲内酯对肾母细胞瘤细胞是否也同样具有生长抑制作用,它是否会增加肾母细胞瘤细胞对长春新碱的化疗敏感性,由此我们开展了相关研究。本研究通过体外培养人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞和建立裸鼠皮下移植瘤模型,结合体内外实验探讨穿心莲内酯联合长春新碱对肾母细胞瘤细胞生物学特性的影响,为穿心莲内酯和长春新碱联合用药成为肾母细胞瘤的一个新化疗方案提供理论依据。方法1.细胞培养与处理方法:将人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞株保存于含15%热灭活胎牛血清的Maccyo’ 5培养液中,在37℃、5%CO2、100%湿度的环境中进行培养。SK-NEP-1细胞按实验需要进行处理,处理方法分别如下:(1)将VCR和AND分别用二甲基亚砜溶剂(DMSO)进行溶解,然后加入细胞培养液中,VCR的浓度分别为3、6、9、12、15nM, AND的浓度分别为5、10、15、20、25μM;(2) VCR和AND用DMSO溶解后一起加入细胞培养液中,VCR的浓度为半数抑制浓度(IC 50),AND的浓度分别为10、20、25μM;(3)细胞使用蛋白激酶B(AKT)活化剂SC-79预处理6小时,VCR用DMSO溶解后加入细胞培养液中,VCR的浓度为10.8nM;(4)细胞使用SC-79预处理6小时,VCR和AND用DMSO溶解后一起加入细胞培养液中,VCR的浓度为10.8nM,AND的浓度为25μMAND。对照组为将以上各浓度实验组相同量的DMSO加入细胞培养液中。处理时间按实验需要分别设置为24、48和72小时。2.细胞增殖检测:使用Cell Counting Kit-8 (CCK-8试剂盒)检测肿瘤细胞的增殖情况。使用GraphPad Prism 6.0软件计算一系列的剂量-反应数据获得单独使用或与AND联合应用时VCR的半数抑制浓度(IC50)。采用CompuSyn软件进行联合用药分析,生成不同浓度的VCR和AND组合时的联合指数(CI),其中可加性、协同性和拮抗性分别由0.9-1.1,<0.9和>1.1的数值反映。3.细胞凋亡及Caspase-3 (半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶)活性检测:应用Annexin V/PI双染色法对各组凋亡细胞进行染色并采用FACScan流式细胞仪分析。采用Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞中Caspase-3的活性。4.细胞自噬检测:使用单丹磺酰尸胺染色(MDC法)对细胞进行染色,采用配备过滤系统的荧光显微镜进行观察自体吞噬泡并计数和拍照。采用透射电子显微镜观察细胞的超微结构检查有无自噬体。5.蛋白印迹法(Western blotting)检测 ERK、p-ERK、p53、p-p53、AKT、p-AKT等细胞蛋白的表达水平。6.裸鼠皮下移植瘤实验:使用BALB/c裸鼠建立SK-NEP-1皮下移植肿瘤模型,购买裸鼠45只,建立模型成功32只。裸鼠模型建立后随机分入四组:对照组(生理盐水,口服,每日一次)、100mg/kg的AND治疗组(口服,每日一次)、0.2mg/kg的VCR治疗组(腹腔注射,每周一次)、VCR和AND联合治疗组,每组8只,连续给药4周。每周测量一次肿瘤体积和裸鼠体重。4周后处死裸鼠,解剖裸鼠剥离原位瘤后测量瘤重,计算抑瘤率,抑瘤率(%)=(对照组瘤重—治疗组瘤重)/对照组瘤重X 100%。移植瘤切片后进行TUNEL凋亡检测及免疫组化分析。7.统计学分析:采用SPSS 13.0统计软件分析数据。统计数据以均数±标准差(x ±s)表示。多样本两组之间的比较采用单因素方差分析,取P<0.05具有统计学意义。结果1.穿心莲内酯联合长春新碱对SK-NEP-1细胞具有协同抑制增殖作用:SK-NEP-1细胞按对照组、VCR (0-15 nM)组和AND (0-25μM)组分别处理24、48、72小时,CCK-8法分析各组细胞的生长抑制情况。结果显示长春新碱的浓度越大、处理时间越长,SK-NEP-1细胞的生长抑制率越高。而不同浓度的穿心莲内酯组SK-NEP-1细胞的生长抑制率均较低。另外CCK-8法分析结果显示穿心莲内酯和长春新碱联合应用时SK-NEP-1细胞的生长抑制率高于VCR组。使用 GraphPad Prism 6.0 软件计算出 VCR 的 IC50为 10.8nM,联合应用10μM、20μM、25μM AND 时 VCR 的 IC50分别为 9.5nM、6.6 nM、5.1 nM, VCR+20μM AND 联合应用组与VCR组之间、VCR+25μM AND联合应用组与VCR组之间的差别均具有统计学意义(P<0.05)。采用CompuSyn软件进行联合用药分析,生成10.8nM VCR分别与10μM、20μM、25μMAND组合时的联合指数,结果分别为0.98、0.66、0.58,提示穿心莲内酯和长春新碱具有协同性。SK-NEP-1细胞分别按对照组、10.8nMVCR 组、10.8nMVCR+10μMAND 组、10.8nMVCR+20μMAND 组、10.8nM VCR+25μM AND组处理48小时后,采用倒置显微镜观察显示在穿心莲内酯和长春新碱联合使用组可见到细胞数量明显减少以及细胞形态的改变。2.穿心莲内酯促进了长春新碱诱导的SK-NEP-1细胞凋亡,Caspase-3依赖性细胞凋亡参与这个过程:SK-NEP-1细胞分别按对照组、10.8 nM VCR组、10.8 nM VCR+10μM AND 组、10.8 nM VCR+20μM AND 组、10.8 nM VCR+25μM AND组处理48小时,使用Annexin V/PI双染色法检测各组细胞凋亡的情况。结果显示对照组早期凋亡和晚期凋亡的细胞数仅占5%,10.8 nM VCR组凋亡的细胞数为 32%,而 10.8 nMVCR 加用 10、20 和 25μM 的 AND 后显著提高了 SK-NEP-1细胞的凋亡率,相应的数值分别为39%、50%和56%。10.8nMVCR+20μMAND组、10.8nMVCR+25μMAND组分别与VCR组相比,两者间的差别均具有统计学意义(P<0.05)。Caspase-3活性检测试剂盒分别检测了五组中Caspase-3底物分裂的比值用以分析Caspase-3的活性。10.8 nM VCR+20μM AND组和10.8 nM VCR+25μM AND组的Caspase-3的活性高于VCR组,两者分别与VCR组之间的差别均具有统计学意义(P<0.01)。3.细胞自噬没有参与穿心莲内酯和(或)长春新碱诱导的SK-NEP-1细胞死亡过程:SK-NEP-1细胞分别按对照组、10.8 nMVCR组、10.8 nMVCR+10μM AND 组、10.8 nM VCR+20μM AND 组、10.8 nM VCR+25μM AND 组处理 48 小时,使用MDC法进行染色,荧光显微镜观察各组中自体吞噬泡的情况。结果显示各组之间无明显差别,MDC染色阳性细胞数均不超过5%。透射电子显微镜观察显示各组细胞内并无明显的自噬体结构形成。4.穿心莲内酯和长春新碱联合应用上调了 p-p53的蛋白表达水平并下调了p-AKT的表达水平:SK-NEP-1细胞分别按对照组、10.8 nMVCR组、10.8 nM VCR+1OμM AND 组、10.8 nM VCR+20μM AND 组、10.8 nM VCR+25μM AND组处理48小时,采用Western blotting分析了五组中p-p53、p-AKT、p-ERK的表达水平。结果表明p-p53在五组中的表达水平逐渐升高,p-AKT的表达水平逐渐下降,而p-ERK的表达水平无明显变化。具体数据显示p-p53的表达水平在10.8 nM VCR+20μM AND处理组中最高。5. AKT活化剂抑制了穿心莲内酯联合长春新碱诱导的SK-NEP-1细胞凋亡:SK-NEP-1细胞分别按对照组、VCR组、VCR+AND组、VCR+SC-79预处理组、VCR+AND+SC-79预处理组处理48小时后进行检测。CCK-8法分别检测了五组中细胞的生长抑制率,结果显示VCR+AND组的细胞生长抑制率高于VCR+AND+SC-79预处理组,两者之间的差别具有统计学意义(P<0.05),而VCR组与VCR+SC-79预处理组间的差别无统计学意义(P<0.05)。Western blotting分析了五组中细胞蛋白的表达情况,结果显示AKT活化剂SC-79抑制了穿心莲内酯和长春新碱联合应用时p-AKT和p-p53的表达水平变化。6.穿心莲内酯联合长春新碱显著抑制了裸鼠皮下移植肿瘤的生长:裸鼠皮下移植肿瘤模型按实验分组治疗4周,结果显示在肿瘤体积及重量方面,VCR+AND组均低于对照组及VCR组,差别具有统计学意义(P<0.05) ; VCR组亦低于对照组,两者之间的差别具有统计学意义(P<0.05);而AND组与对照组之间的差别无统计学意义(P>0.05)。移植瘤TUNEL凋亡检测结果提示AND和VCR联合治疗组细胞凋亡数明显增多,与对照组和VCR组相比,均有统计学意义(P<0.05) , AND组与对照组之间的差别无统计学意义。移植瘤免疫组化分析结果提示AND和VCR联合治疗组p-p53蛋白的表达水平最高,而p-AKT蛋白的表达水平最低,与对照组及VCR组相比,差别具有统计学意义(P<0.05)。结论1.穿心莲内酯联合长春新碱有效抑制了体外人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞和体内SK-NEP-1细胞移植肿瘤的生长。穿心莲内酯自身对SK-NEP-1细胞并没有显著的生长抑制效果,但它增加了 SK-NEP-1细胞对长春新碱的敏感性。2.穿心莲内酯联合长春新碱通过P13K-AKT-p53信号通路诱导SK-NEP-1细胞的凋亡。3. Caspase-3依赖性凋亡参与穿心莲内酯和长春新碱诱导的SK-NEP-1细胞死亡过程。4.穿心莲内酯和长春新碱对SK-NEP-1细胞的生长抑制不通过细胞自噬途径。