论文部分内容阅读
目的:利用雾化吸入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制备幼年SD大鼠急性肺损伤(acute lung injury,ALI)模型,探讨ALI动物模型肺组织中炎症因子如Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)-4、核转录因子(nuclear factor,NF)-κB、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白介素(interleukin,IL)-17a以及血管因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管假性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的变化,观察ALI动物模型输入外源性骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)后肺组织损伤的修复程度。建立LPS攻击大鼠肺泡II型上皮细胞(alveolar type II epithelial cells,AECⅡ)的模型,模拟内毒素性肺损伤,用间接共培养法探索BMSCs是否能减轻LPS对AECⅡ的损伤并促进其修复。研究方法:1、动物实验:144只雄性幼年SD大鼠用随机数字表法分为3组:LPS组(模型组)、对照组、LPS+BMSCs组(治疗组),每组再分为3h、6h、12 h、1d、2d、3d、7d、14d,8个亚组(每组各6只)。模型组及治疗组雾化吸入LPS(5mg/ml,2ml,20min)来建立幼年鼠ALI模型,对照组同期雾化吸入等量生理盐水,1h后,治疗组经尾静脉注射BMSCs(1×10~7/kg,1×10~7/ml),模型组、对照组经尾静脉注射等量培养基(DMEM)。HE染色组织切片观察肺组织病理形态变化,W/D比值和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)细胞计数及蛋白浓度评价肺水肿程度,并应用免疫组织化学法检测VEGF、NF-κB、IL-17a及免疫印迹法检测VEGF、vWF、TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-17蛋白表达的变化。2、细胞实验:分四组A:DMEM+BMSCs组;B:DMEM组;C:LPS组;D:LPS+BMSCs组。C、D组用10μg/ml的LPS刺激AECⅡ,A、B组加入等量的DMEM,4h后,A、D组在孔径0.4μm transwell小室内加BMSCs间接共培养,B、C组只放入小室,不加BMSCs,培养24h后,利用细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测各组AECⅡ的活性。结果:1、动物实验:肺组织病理学观察显示:模型组肺组织可见典型的炎症病理改变,包括肺泡正常结构消失,肺泡壁增厚、肺泡毛细血管充血、肺泡腔内可见出血及炎性细胞浸润、肺间质水肿、透明膜形成等肺损伤性病变;治疗组肺组织损伤程度较模型组明显减轻。与对照组相比,模型组幼年鼠早期肺组织W/D比值、BALF细胞计数及蛋白浓度以及VEGF、vWF、TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-17(a)蛋白表达显著增高(P<0.05),而治疗组上述指标的检测结果较模型组显著降低(P<0.05)。2、细胞实验:用CCK-8检测各组吸光度(OD值),A组和B组的OD值比较无差异,说明BMSCs对正常AECⅡ无作用;而C组的OD值明显低于B组,差异显著(P<0.05),说明LPS制备AECⅡ损伤模型成功,D组OD值明显高于C组,差异显著(P<0.05),说明BMSCs能减轻LPS对AECⅡ的损伤并促进其修复。结论:LPS致ALI的发病机制可能与VEGF、vWF、TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-17(a)蛋白表达升高有关。应用BMSCs干预后,治疗组幼年鼠肺组织损伤程度明显减轻,并且VEGF、v WF、TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-17(a)蛋白表达较模型组显著降低,提示BMSCs可抑制ALI肺组织的炎症反应并促进肺组织损伤的修复。BMSCs对正常的AECⅡ无作用,但是能减轻LPS对AECⅡ的损伤并促进其修复。