结直肠癌又称为大肠癌(colorectal cancer,CRC),一种常见的消化道肿瘤。CRC是美国恶性肿瘤的第二位。在我国,CRC居恶性肿瘤的第五位。CRC的预后与肿瘤的分化程度、是否发生侵袭转移息息相关,原位癌(I期)的5年生存率超过90%,而发生远处转移(IV期)时,5年生存率仅约为10%。为此,迫切需要探索更具特异性和敏感性的生物标志物,以提高对CRC的筛查和诊断效果,早期诊断、治疗CRC。近年来,蛋白质组学技术的快速发展使其在各种恶性肿瘤的研究中也有广泛应用,为进一步深入探讨肿瘤的发病机制、开展肿瘤的个体化治疗提供了一种新的手段。本研究旨在应用蛋白组学的方法研究结直肠癌肿瘤组织与癌旁组织之间蛋白表达谱的差异,建立结直肠癌的差异表达谱,以期筛选出可用于结直肠癌辅助诊断的生物标记物。在本研究从差异表达蛋白谱中选取ATP5B作为目标蛋白,通过B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,分析蛋白ATP5B的表达与患者临床病理参数的相关性。本研究共分为四部分:第一部分:TNMⅢ期结直肠癌与癌旁组织的差异蛋白谱的建立实验方法:1.标本为20对未接受任何治疗的结直肠腺癌及配对癌旁组织(癌旁组织距癌组织>10厘米),且经病理学证实为TNMⅢ期腺癌。2.提取标本总蛋白,测定蛋白质浓度。3.制备蛋白水解多肽混合物。4.二维液相色谱法分离样本。5.通过LTQXL离子肼质谱仪对二维色谱洗脱的多肽进行检测。6.对质谱数据进行生物信息学分析,找到癌组织与癌旁组织差异表达的蛋白质。结果:1、经分析,肿瘤组织中获得了蛋白点567个;癌旁组织中蛋白质点获得了434个。经比对,检索,两种组织中差异表达的蛋白质30个。2、上调表达蛋白(20个):fbln1、atp5b、tpm4、fga、gstp1、hist1h3j、igha1、serpinh1、tubb3、igha1、tpm3、ckap4、igha2、postn、fgb、fgg、pkm2、hist1h2ae、myh10和tubb。3、下调表达蛋白(10个):synm、myh11、pkm2、krt10、flnc、h2afx、cap1、myl6、tubb2a、tln1。4、从差异表达蛋白谱中选取atp5b作为目标蛋白进行后续研究。第二部分:atp5b基因扩增、载体构建及诱导表达融合蛋白实验方法:1.根据genbank-nucletide数据库中的atp5b基因序列,扩增atp5b目的基因。2.连接atp5b目的基因与pet28a,构建原核表达载体,转化bl21细胞,获得表达菌株bl21(de3)(pet28a/atp5b)并诱导表达。3.超声破碎菌体,镍琼脂糖亲和层析纯化目的蛋白。4.sds-page检测纯化蛋白。5.westernbloting分析融合蛋白。实验结果:1.成功构建pet28a/atp5b(原核表达质粒),经dna测序,genbank-nucletide比对,确定为目的序列。2.经转化、诱导表达、纯化,sds-page及westernbloting鉴定,获得纯化的目的蛋白。第三部分atp5b单克隆抗体制备、纯化、鉴定实验方法:1.制备atp5b蛋白免疫原,皮下注射免疫小鼠。取免疫小鼠脾脏,制备细胞,与骨髓瘤细胞融合。2.HAT选择性培养,ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株;3.阳性杂交瘤细胞株腹水制备及腹水抗体效价检测;4.亲和层析法纯化腹水中单克隆抗体;5.SDS-PAGE分析纯化的单克隆抗体,常染色体染色分析杂交瘤细胞核型。实验结果:1.得到1株稳定分泌抗人ATP5B单克隆抗体的杂交瘤细胞株;2.抗体效价达1:240000,抗体纯度达95%以上。第四部分ATP5B在组织中的差异表达及临床病理参数分析实验方法:1.收集30对结直肠癌组织及癌旁组织;2.根据病理诊断TNM分期将临床病理资料分组;3.免疫组化法检测ATP5B在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达,并分析ATP5B表达与结直肠癌患者临床参数的相关性。实验结果:1.通过免疫组化观察到结直肠癌组织和癌旁组织中均可检测到ATP5B阳性表达,结直肠癌组织中表达率水平显著高于癌旁组织。2.ATP5B蛋白阳性表达率与结直肠癌的肿瘤分化水平及淋巴结转移有关:在肿瘤伴淋巴结转移的肿瘤组织中ATP5B蛋白阳性表达率较高。通过以上研究,我们得出以下结论:1.本研究成功建立了结直肠癌组织与癌旁组织的差异蛋白谱。2.成功建立了ATP5B蛋白的杂交瘤细胞株,并进行了纯化与鉴定;同时制备了ATP5B蛋白的单克隆抗体,为后续ATP5B蛋白功能的研究及单抗的临床应用奠定了基础。3.验证了结直肠癌组织中ATP5B的表达量显著高于癌旁组织。4.证实了ATP5B蛋白与结直肠癌分化程度、淋巴结转移的关系,为判断结直肠癌疾病的发展提供了潜在的依据。