论文部分内容阅读
20世纪80年代，在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术的基础上，基因打靶技术开始发展起来。通过基因打靶技术可以在特定位置插入外源基因，实现外源基因的定点整合；也可以对内源基因进行定点突变或替换，实现对内源基因的修饰。目前介导基因打靶的主要技术有：锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator–like effectornucleases， TALEN)和最近发展起来的CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats RNA)系统。本研究分别以拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvy-shikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)基因EPSPS，蔗糖非发酵1相关蛋白激酶(sucrose non-fermenting-1-related protern’kinase,SnRK)基因SnRK2.2和SnRK2.3为靶基因，构建针对靶基因的TALEN打靶载体，转化拟南芥并获得转基因植株，对转基因拟南芥中靶基因的基因突变情况进行了初步分析。主要研究结果包括：1、对拟南芥EPSPS基因进行体外定点突变并研究突变基因的草甘膦抗性。通过PCR方法克隆了拟南芥EPSPS基因，对其进行定点突变，并将野生型基因(AtEPSPS)和突变基因(AtTIPS)分别转化EPSPS基因缺陷型大肠杆菌菌株ER2799。草甘膦抗性鉴定结果表明，含AtTIPS基因的重组菌株在20mM草甘膦胁迫条件下长势良好，而含AtEPSPS基因的重组菌株在5mM的草甘膦胁迫条件下即受明显抑制。同时将两个基因分别构建到植物表达载体中，并转化野生型拟南芥。转AtTIPS基因拟南芥比野生型及转AtEPSPS拟南芥具有更高的草甘膦抗性，表明两个氨基酸发生突变的AtTIPS具有草甘膦抗性，这为下一步对拟南芥内源EPSPS基因进行定点突变并获得抗草甘膦拟南芥的研究奠定了一定基础。2、以拟南芥EPSPS基因为靶基因，选择打靶位点并构建识别打靶位点两侧序列的TALEN重复序列。两个TALEN重复序列之间用剪切肽序列相连，置于pER8载体17β-雌二醇诱导启动子下构建植物表达载体pER8-L-R，并转化野生型拟南芥获得转基因拟南芥植株。对T1代转基因拟南芥植株用17β-雌二醇处理，对17β-雌二醇处理后的转基因拟南芥内源EPSPS基因的突变情况进行了初步分析。3、以拟南芥SnRK2.2和SnRK2.3基因为靶基因，在两个基因的保守区域设计TALEN打靶位点，以期实现一个载体同时对两个基因进行打靶。以pCambia3301为骨架载体，经设计合成的两个TALEN重复序列分别置于CaMV35S启动子下,构建植物表达载体并转化野生型拟南芥，对转基因拟南芥SnRK2.2和SnRK2.3基因的突变情况进行了初步分析。