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胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)是具有自我更新和多向分化潜能的胚胎细胞,具有向机体各种组织细胞分化的能力,又称为全能干细胞。小鼠二倍体胚胎经电融合可产生四倍体胚胎,这些胚胎与孤雌、孤雄生殖一样不能发育成正常个体。ES细胞与四倍体胚胎形成嵌合体的过程中,ES细胞广泛参与胚体、尿囊、羊膜、绒毛膜中胚层和卵黄囊中胚层的形成,而四倍体来源的细胞主要分布在胚外组织,如滋养层、卵黄囊膜、尿囊膜、胎盘等,几乎不参与胎儿本身的形成。因此,如果将ES细胞与四倍体胚胎嵌合,使二者的发育能力互相补偿,就有可能得到完全由ES细胞发育而来的个体,这种技术被称为四倍体补偿技术(tetraploid embryo complementation),所得到的小鼠称为ES小鼠。Nagy等在1993年首次用聚合法得到了完全由ES细胞发育而来的ES小鼠。随后,更多人利用四倍体囊胚注射法来获得ES小鼠。1.电融合获得四倍体胚胎及其发育能力比较利用昆明小白鼠2细胞期胚胎进行电融合、经体外培养得到四倍体囊胚,对电融合条件进行了摸索,结果在交流电1-2V排序、直流电50V电击、脉冲时程35μs、脉冲次数2次的条件下2细胞融合率达到99.5%,囊胚率达到74.7%,与正常2N囊胚率(84.2%)相比无显著差异,说明四倍体胚胎与正常囊胚的的发育能力相当。2.绿荧光干细胞的体外培养及鉴定采用国产丝裂霉素处理小鼠成纤维细胞作为饲养层来接种胚胎干细胞,丝裂霉素的浓度为30μg/ml,处理4h；按常规的方法培养ES细胞,ES细胞完全培养基为DMEM,内含0.1mmol/Lβ-巯基乙醇,50U/ml青霉素,50 mg/L链霉素,15%胎牛血清,1000 U/ml LIF。ES细胞在饲养层上呈克隆状生长,具有良好的形态,用碱性磷酸酶染色、SSEA-1染色、OCT-4染色对ES细胞进行鉴定均为阳性,表明ES细胞可用于后续实验。3.ES细胞的囊胚注射及胚胎移植采用Eppendorf显微操作系统将干细胞注射入囊胚。每枚四倍体囊胚注射15个左右的ES细胞,将注射后胚胎移植到2.5天假孕母鼠子宫中,每侧移植10枚左右,等待自然分娩或剖腹产。结果注射ES细胞到四倍体囊胚后,可见绿荧光ES细胞掺入内细胞团；移植到假孕2.5天的母鼠子宫内,子宫膨大且子宫内膜可见绿荧光,但未出生小鼠,表明可能是胚胎着床发育到一定阶段被吸收。