论文部分内容阅读
寡核苷酸适配体又称适配体(Aptamer),传统的筛选方法是由指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选得到的能够与相应配体特异性紧密结合的一小段ss DNA或RNA分子。适配体具有靶标广、亲和力高、特异性强等优点,在基础研究、蛋白质组学研究、临床诊断与药物治疗等方面应用广泛。本研究以食源性致病菌副溶血性弧菌为研究对象,基于X-Aptamer筛选试剂盒筛选得到与副溶血性弧菌高亲和力、高特异性结合的适配体,并将其作为识别元件,结合纳米金粒子构建了特异、灵敏、快速、可视化的副溶血性弧菌检测新方法,为丰富和提高食源性致病菌检测技术提供了新思路和新方法。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是常见的海洋性嗜盐性食源性致病菌,主要存在于海产品和腌酱菜等高盐食品中,食用了受副溶血性弧菌污染的食物后,可能会引起胃肠道反应,例如腹泻,头痛,呕吐,恶心和腹部绞痛等。本研究旨在筛选特异性识别副溶血性弧菌的高亲和力适配体。首先,使用X-Aptamer适配体筛选试剂盒快速筛选检测副溶血性弧菌的适配体。第一轮阴性筛选利用反筛菌金黄色葡萄球菌将富集的副溶血性弧菌适配体大样本从微球库上释放出来,通过第二轮的阳性筛选来排除“假阳性”适配体,并设计第二次下拉筛选再次排除非特异性适配体;筛选得到的适配体序列通过PCR扩增,再通过琼脂糖凝胶电泳和高通量测序方法得到适配体的序列及丰度,并通过云端智能软件导出适配体核酸序列,修饰并合成;基于QGRS软件并应用实时定量PCR(q PCR)技术对筛选出的适配体与副溶血性弧菌进行特异性的分析,选出特异性最高的适配体序列ID12。其次,为了进一步获取适配体ID12与副溶血性弧菌外膜蛋白的结合位点,提取了副溶血性弧菌的外膜蛋白,并进一步通过SDS-PAGE以及全蛋白Label-free定性蛋白质组学分析,获得66种外膜蛋白信息;其中的P51002外膜蛋白为外膜蛋白K(outer membrane protein K,Omp K),Omp K为副溶血性弧菌保守序列,其COG description显示Nucleoside-binding outer membrane protein,故通过Modeller 9.20建模获得P51002三维结构:呈桶状蛋白,蛋白中心是由β折叠组成疏水空腔;通过Mfold server预测适配体ID12二级结构,同时经DS viewer模拟被W、X、Y修饰的碱基T,挑选最优打分构象并经过RNA composer构建适配体ID12三维结构:呈回环状,局部类似发夹结构,与DNA双链不同,为反向双螺旋结构;并将二者通过ZDOCK程序进行对接,获得重要结合位点:外膜蛋白P51002上的作用位点有:Phe182,Tyr183,Phe184,Asn187,Ser189;适配体ID12参与相互作用的位点有:W19,Y20,T37,G38,C39,G40,A41;副溶血性弧菌外膜蛋白P51002与适配体ID12相互作用力为疏水、范德华、氢键及静电作用;其中,适配体ID12的W19,Y20位更靠近外膜蛋白P51002的Tyr183,Phe184等芳香族氨基酸残基,主要为疏水作用。研究结果表明,经修饰的适配体更易于与靶标结合且结合位点为外膜蛋白K,这对于进一步阐明适配体与目标菌结合机制具有积极意义。最后,采用化学还原法制备特定尺寸的酒红色纳米金,通过紫外可见吸收光谱仪和透射式电子显微镜对试验结果进行表征。由于纳米金表面带负电荷,金颗粒之间通过静电排斥保持纳米金的稳定性,在反应体系中加入高浓度盐,破坏纳米金溶液的稳定性,会导致纳米金发生凝聚,溶液由红色变为蓝色;当适配体存在的情况下,适配体在自由状态下通过暴露的带正电的碱基和纳米金表面的负电荷发生静电作用而直接吸附到金表面,吸附有适配体的纳米金在高浓度的盐溶液下仍可保持稳定,溶液仍为红色。基于以上原理,本研究模拟了常见海产品中副溶血性弧菌的不同污染情况,将污染了不同菌数的海鲜肉的样液和纳米金溶液与一定浓度的适配体置于96孔板中,加入高浓度盐溶液,含有不同污染程度海鲜肉样液的反应体系中呈现出不一样的颜色变化,将该方法称为适配体-纳米金比色法。结果表明(1)选用柠檬酸三钠作为还原剂,1%的柠檬酸三钠的添加量为10 m L,在无保护剂的情况下,100℃下持续加热10 min时,纳米金颗粒直径在13-17 nm之间,在此参数下制备的纳米金溶液的分散性好、大小均匀且呈酒红色。(2)不同浓度的适配体ID12与副溶血性弧菌(1×10~8CFU/m L)均有颜色变化,当适配体在100 nmol/L时颜色变化最明显。(3)选择含有沙门氏菌、单核增生李斯特菌、大肠杆菌的菌液作为阴性对照组,适配体ID12可对副溶血性弧菌特异性结合,即只在含有副溶血性弧菌的反应体系种发生颜色变化。(4)适配体-纳米金比色法对副溶血性弧菌最低检出限为1×10~4CFU/m L,最高为1×10~9CFU/m L,最佳显色时间为5 min。综上,本论文筛选得到了副溶血性弧菌适配体ID12,利用其与靶标的高亲和力、高特异性,结合纳米金,构建了特异、灵敏、快速、可视化的检测方法,为基于新型生物传感器检测食源性致病菌新技术提供了良好的技术支持和理论基础。