【摘 要】
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Bax属于Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白,其二聚体的生成和再分布在线粒体凋亡途径中起着重要作用。隐花色素2(CRY2)是拟南芥植物(Arabidopsis thaliana)中的一种蓝光受体,其N端光裂解酶同源区域(PHR)在体外响应蓝光,促使CRY2产生二聚或多聚体。本篇论文利用CRY2聚集的特点,构建并获得融合蛋白CRY-Bax,研究蓝光刺激下光敏感蛋白CRY2介导的Bax聚合以及促细胞凋亡
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Bax属于Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白,其二聚体的生成和再分布在线粒体凋亡途径中起着重要作用。隐花色素2(CRY2)是拟南芥植物(Arabidopsis thaliana)中的一种蓝光受体,其N端光裂解酶同源区域(PHR)在体外响应蓝光,促使CRY2产生二聚或多聚体。本篇论文利用CRY2聚集的特点,构建并获得融合蛋白CRY-Bax,研究蓝光刺激下光敏感蛋白CRY2介导的Bax聚合以及促细胞凋亡的现象。构建CRY-Bax、Bax和CRY2PHR的真核表达质粒后,瞬时转染HEK293T或Hela细胞,半定量RT-PCR和免疫印迹技术确定基因表达,结果表明CRY-Bax、Bax和CRY2PHR在HEK293T和Hela细胞中可以表达,且与未转染组相比表达均明显上调。Hoechst 33258染色结果发现,蓝光刺激后,过表达C RY-Bax组细胞凋亡比率增加;流式检测结果与Hoechst 33258染色结果相同,且发现在蓝光刺激下细胞的总凋亡率与蓝光刺激时间呈正相关性(正常细胞组、CRY2PHR和Bax质粒转染组细胞做为对照组)。免疫印迹显示,在过表达CRY-Bax的细胞中,cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白含量显著上调。为了进一步确定蓝光刺激下,CRY-B ax诱导的细胞凋亡是如何发生发展的,采用Native-PAGE电泳、SDS-PAGE电泳(DSS交联)后免疫印迹检测,结果表明蓝光可诱导CRY-Bax重组蛋白形成蛋白二聚体;分离胞浆蛋白和线粒体蛋白后,免疫印迹分析表明,蓝光诱导后CRY-Bax在线粒体中的分布量增多。综上所述,本论文成功获得了融合蛋白CRY-Bax,在真核细胞内,蓝光刺激后,CRY-Bax聚集并转移到线粒体,启动caspase级联反应,最终促使细胞发生凋亡,且细胞的凋亡比率与蓝光刺激时间呈正相关性。本文对CRY2介导的Bax聚合以及促凋亡现象的研究表明,在肿瘤治疗领域中有望将光照引入其中,利用光来调节蛋白结构,进一步改变蛋白功能,这在医学科学研究方面具有一定的发展前景。
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