第一章绪论组织工程技术的发展并引入至医学领域,为21世纪移植医学和外科手术重建医学的发展带来了福音。过去的二十年里,组织工程膀胱领域的研究取得了突破性的进展。由于平滑肌在膀胱的储尿和排尿功能中发挥了重要的作用,而目前仍缺乏理想的膀胱平滑肌种子细胞。本课题从这一难点出发,旨在为组织工程膀胱研究寻求一种理想的种子细胞,以促进膀胱平滑肌再生、血管化以及膀胱功能的恢复,并对其作用机制做了相关研究。第二章平滑肌祖细胞的分离、培养与鉴定我们采用密度梯度离心法分离兔外周血单个核细胞,采用EGM-2培养基进行培养,在PDGF-BB和TGF-β1的诱导下培养出平滑肌祖细胞。还通过酶消化法分离培养了兔膀胱平滑肌细胞。以分化成熟的膀胱平滑肌细胞作为阳性对照,通过流式细胞术、免疫荧光和real-time PCR技术对SPC进行鉴定,同时还将培养的SPC进行单细胞成克隆分析,观察其自我更新潜能。并采用卡巴胆碱药物刺激,观察SPC的收缩活性。结果表明,我们成功地分离和培养出了 SPC和RBSMC,分离出的SPC可表达平滑肌细胞特征性的基因和蛋白标记如SMA、Desmin、Calponin、SM22和SMMHC等,还表达干/祖细胞的标记KDR、CD133、CD29和CD90。同时还具有祖细胞的特征,增殖能力强。将分离出的SPC还可在卡巴胆碱刺激下产生收缩反应,进一步证明其具有平滑肌的特性。通过以上研究结果表明,我们所培养的SPC具有很高的增殖潜能,纯度高,具有平滑肌特征,可作为组织工程膀胱的种子细胞。第三章平滑肌祖细胞促进膀胱平滑肌细胞增殖、迁移和刮伤愈合我们采用第二章的方法分离和培养出兔外周血SPC和兔BSMC,将SPC和RBSMC进行饥饿培养,收集饥饿培养后的细胞上清液,在其中加入PDGF-BB和TGF-β1的中和抗体,进行RBSMC的增殖、迁移和刮伤愈合实验,观察SPC对RBSMC的作用。此外,还通过ELISA和real-time PCR检测SPC上清液中PDGF-BB的含量以及SPC中PDGF-B基因的表达。结果发现,SPC上清液可以显著地促进RBSMC的增殖、迁移和刮伤愈合能力(P<0.05)。加入anti-PDGF-BB中和后,可以明显地降低SPC促进RBSMC增殖和迁移的作用,但是加入anti-TGF-β1中和后,对RBSMC的迁移无明显影响。通过检测发现,SPC分泌PDGF-BB的量明显高于RBSMC(P<0.05),SPC的PDGF-B基因表达也明显高于RBSMC(P<0.05)。本研究表明,SPC可以分泌PDGF-BB,通过旁分泌机制促进RBSMC的增殖、迁移和刮伤愈合。这一结果为SPC作为种子细胞在组织工程中的应用提供了更多的依据。第四章平滑肌祖细胞体外荧光标记及细胞-支架材料复合物的体外构建我们采用第二章的方法分离和培养出兔外周血SPC,采用荧光染料CM-DiI进行标记,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测标记效果和传代后的细胞标记率。同时,进行细胞爬片培养后免疫荧光染色,观察标记后细胞表达平滑肌特征标记的情况。进行台盼蓝排斥实验、细胞粘附实验、细胞增殖实验和细胞迁移实验,观察标记后的SPC的存活率以及粘附、增殖和迁移能力的变化。此外,我们还将标记后的细胞种植到支架材料猪BAM上,构建细胞-支架材料复合物,通过组织学染色观察细胞的生长情况。结果发现,培养4天左右可见SPC开始生长,一周后出现SPC克隆。通过免疫荧光和流式细胞术分析,CM-DiI标记率为96%左右,连续传代2周后标记率仍在40%以上。标记后的细胞可表达α-SMA、Calponin、PCNA。同时可发现,标记后的细胞存活率无明显降低,细胞粘附能力、增殖能力和迁移能力无明显改变。将细胞种植到BAM上,通过组织学染色可发现,SPC可快速长入BAM中。此外,PDGF-BB可以促进SPC在BAM中的生长,呈剂量依赖性。本研究证明采用CM-DiI标记SPC操作简便,效果好,不改变细胞表型,不影响细胞的存活率和粘附、增殖及迁移能力,可作为SPC的荧光示踪剂。标记后的SPC可快速长入BAM中,PDGF-BB对于SPC在BAM中的生长具有促进作用,并呈剂量依赖效应。第五章 平滑肌祖细胞促进组织工程膀胱平滑肌再生和功能恢复采用前期研究中制备的一种保留了生物活性因子并具有较高的孔隙率、合适孔径的猪膀胱无细胞基质作为支架材料,以分离培养的兔外周血SPC作为种子细胞,以兔为实验动物,进行膀胱替代,观察SPC促进组织工程膀胱再生和功能恢复的作用。单纯应用未接种细胞的BAM进行兔膀胱替代作为对照组。研究结果显示,术后1月时两组替代区域的边缘区和中心区的尿路上皮细胞均已再生良好。在术后各时间点,实验组中替代平滑肌束密度、微血管密度和数目以及神经束的再生均明显高于对照组(P<0.05),但两组中的替代中心区神经束的再生无明显差异。实验组的膀胱功能恢复明显优于对照组(P<0.05)。同时,SPC还直接参与构成了再生膀胱的平滑肌组织。通过以上研究结果表明,采用SPC作为种子细胞进行膀胱替代重建,可以显著地促进组织工程膀胱平滑肌再生、血管化和神经再生,并促进膀胱功能的恢复。全文结论本研究中,我们成功地分离培养了兔外周血SPC,并从细胞水平、蛋白水平和基因水平进行全面地鉴定。所培养的细胞可满足组织工程膀胱研究的需要。我们通过研究发现,SPC可以分泌生物活性因子PDGF-BB,从而促进膀胱平滑肌细胞的增殖、迁移和刮伤愈合。我们采用CM-DiI作为荧光示踪剂进行SPC的体外标记,这种方法切实可行,且操作简便。经CM-DiI标记后的SPC可以在支架材料BAM中生长,经体外研究证实所培养的SPC-BAM复合物可以用于膀胱替代研究。我们研究发现,采用SPC作为平滑肌种子细胞,构建SPC-BAM复合物进行膀胱替代,可以促进组织工程膀胱平滑肌再生、血管化和神经再生,并促进膀胱功能的恢复。研究还发现,SPC可以直接参与平滑肌的再生,同时还通过旁分泌作用促进组织工程膀胱再生。通过本课题的研究,进一步明确了种子细胞在组织工程膀胱中的作用,为组织工程膀胱的实验研究和临床应用积累了一些经验。