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一、研究背景和研究目的:胰腺创伤发病率约为0.4/10万,仅占腹部外伤的1%~3%。但由于其致伤后病死率高达20%,胰瘘、肠瘘、腹腔感染、出血等严重并发症发生率达40%,因此胰腺创伤在腹部创伤中占重要地位。现有研究主要集中在胰腺创伤后患者的外科学救治、创伤后并发症的防治等方面,对于其伤情变化机制的研究则极为缺乏。研究单器官创伤的伤情变化,有助于排除多器官损伤的影响,更好地了解该器官创伤后的发病机制,掌握其伤情演化特点,提高该病的治疗效果。传统的胰腺损伤动物模型大多存在致伤因素不纯、致伤范围难以控制、重复性差、操作烦琐等问题,故建立单纯的胰腺创伤动物模型,继而对其病理、病理生理学衍变的研究是个急待解决的课题。胰腺创伤后的伤情变化有什么特点呢?这些特点和急性胰腺炎的病情变化是相同的吗?磷脂酶A2(Phospholipase A2 ,PLA2)是一类能够在磷脂甘油部分的Sn - 2位点选择性断裂酯键的酶。急性胰腺炎(AP)时,当PLA2被激活后,可作用于细胞膜和线粒体膜的甘油磷脂,使其分解为溶血卵磷脂,从而溶解破坏细胞膜和线粒体膜的脂蛋白结构,使细胞死亡。胰腺创伤后,PLA2是否和AP时一样被激活?胰腺创伤后胰腺细胞PLA2各基因、蛋白表达水平和组织内定位情况又是怎样的呢?目前没有应用于临床的特异性PLA2的酶活性抑制剂,最早于1973年在海绵内分离的Variabilin(呋喃二倍半萜烯-4-羟乙酰乙酸内酯)已在体外被证实为PLA2的有效特异抑制剂,2004年人们用化学合成法得到Variabilin后,其来源问题已成功解决。而Variabilin是否能在生物体内发挥抑制胰酶激活过程中关键步骤―PLA2激活的目的,发挥创伤后保护作用呢?二、实验方法为了解答上述问题,本研究实验设计如下:首先,利用BIM-Ⅲ型多功能生物撞击机,建立急性胰腺创伤Wistar大鼠模型作为实验组,而对照组为开腹后不激惹胰腺,相同建模开腹时间后关腹。研究在不同压强的外力作用下,模型指定时相点的一般情况和存活率、大体、光镜及电镜下胰腺组织的病理变化和常规酶学变化,得到稳定建模致伤压强;然后,固定致伤压强,研究胰腺创伤后不同时相点的伤情变化(包括一般情况、胰腺组织的病理变化、AMS和LPS活性变化、血常规、血生化、胰腺细胞凋亡以及胰腺组织细胞生长周期变化情况);再次,采用3H-花生四烯酸标记大肠杆菌膜作为底物的方法检测大鼠胰腺创伤后不同时相点的PLA2活性,利用荧光定量RT-PCR技术检测其亚型mRNA的表达,利用Western blot和IHC技术检测其蛋白表达量和蛋白组织定位;最后,将Variabilin体内应用于急性胰腺创伤大鼠模型,研究其对模型的保护作用和对PLA2的抑制效应。三、实验结果及结论1. 400KPa冲击气流作用后24h,大鼠存活率为85%,明显高于600KPa组的40%。因此,稳定建模的冲击气流压力上限为400KPa,可更经济地用于创伤后亚急性期的伤情特点的观察。2.胰腺大体病理变化主要为外力作用后当时,大鼠胰腺局部出血和伤后血性腹水形成,腹水量和胰腺重量与致伤压力大小呈正比。光镜下胰腺细胞空泡形成、水肿、坏死指数以400KPa以上压力组为明显,这与非创伤因素引起的AP时的病理变化相似;但与AP比较,PT炎细胞浸润不多、出血更加明显。电镜下可见内质网扩张、断裂,核糖体脱落,溶酶体增多,血管内皮细胞肿胀、血管淤血等在各压力均可发生,线粒体肿胀变形以400KPa以上压力组为明显。3.不同大小外力作用下,伤后24h血、腹水的AMS、LPS活性均较对照组明显增高,AMS在各实验组间无明显差异,LPS在400KPa以上压力组与其下压力组之间有明显差异, 400KPa以下压力组与对照组比较亦有明显差异。因此可认为在伤后24h内,仅可根据AMS的变化来判断是否存在胰腺创伤,而不能根据AMS值预测创伤的严重程度;而LPS如明显增高可预测存在严重的胰腺创伤。4.固定400KPa压力创伤胰腺后,血性腹水量在6h时达到峰值,24h时减少,而胰腺湿重则在24h时达到峰值,此后逐渐下降。光镜下,出血、空泡形成、水肿、坏死是最显著的变化,而炎性细胞浸润较少。以上病理指数在6-24h时达到高峰,此后逐渐下降,在7d时有明显好转。电镜下,粗面内质网、核糖体、线粒体、溶酶体和毛细血管内皮细胞、细胞间导管早期均有改变,且在72h后开始逐渐恢复正常形态。5.创伤后6h,血液WBC和W-LCR均明显升高,24h最高,此后逐渐下降;RBC、HGB和血钙水平却在72h内逐渐下降,7d时稍有增加;PLT和血钾水平则是先降后升。血AMS在伤后6h开始上升,24h达到高峰,此后逐渐下降。LPS上升亦可在伤后6h开始上升,但在72h才达到高峰,7d时仍维持于较高水平。而腹水AMS、LPS在7d前均较高。这对于病情的判断有较大临床意义:急性胰腺创伤后,血清AMS可作为早期诊断标准,血清LPS可作为特异诊断标准;腹水AMS和LPS不能作为判断预后的标准,只能作为辅助诊断的指标。6.采用TUNEL法和流式细胞技术检测发现,胰腺创伤后细胞凋亡6h就出现且为高峰,此时PI却下降,说明创伤后早期主要为细胞衰亡效应;24h后,AI随着时间的发展逐渐下降,而PI却开始随时间增加而逐渐增加,7d时达到最高值,说明后续细胞修复机制在24h时已开始激活,这种修复机制和破坏机制在创伤后期持续同时存在。7.胰腺创伤后6h大鼠血清和胰腺组织PLA2活性即开始升高,24h达峰值,此后虽逐渐下降但仍高于对照组。这种变化以胰腺组织的PLA2活性增高最为显著,而血清PLA2活性亦有显著增高。因此在胰腺创伤后6h-7d均可检测血PLA2活性。8.荧光定量RT-PCR显示,胰腺创伤后表达增强的基因主要为sPLA2,其次为cPLA2,而iPLA2则稍有增加。伤后24h前PLA2各亚型的mRNA表达量均呈随时间而上升的趋势,cPLA2和sPLA2在此时出现最高水平,而iPLA2的表达峰则在72h,这可能和cPLA2和sPLA2主要由胰腺组织产生而iPLA2主要存在于胰腺外组织有关。而Western Blot定量结果也从蛋白水平证实了PLA2各亚型表达的情况与转录水平一致的特点。9.用IHC技术对酶蛋白亚型组织定位方面:胰腺内的表达以sPLA2和cPLA2增加为主,6h时即遍布于胰腺腺泡细胞;24h时由于胰腺细胞的大量破坏,腺泡细胞外均可见sPLA2和cPLA2的高表达;72h后细胞内外sPLA2和cPLA2逐渐下降。而iPLA2蛋白组织定位变化并不明显,结合前面的实验结果,初步推断出iPLA2在胰腺创伤后并不是主要致病因子。10.将海绵提取物Variabilin体内应用于胰腺创伤模型后,我们发现其表现出较强的抑制血清和胰腺细胞内PLA2活性的作用。使模型存活率提高;可减轻损伤后胰腺坏死和水肿程度;减少血性腹水形成等并发症的发生;促进胰腺损伤修复和机体基本机能恢复,从而发挥良好的保护作用。综上所述,本研究主要结论如下:1.一种有效、稳定、经济的Wistar大鼠急性胰腺创伤动物模型成功建立。2.在胰腺创伤6h-24h是伤情加重的激进期,机体修复机制在创伤后24h时已开始激活,这种修复机制和损伤机制在创伤后期持续同时存在。3.创伤后PLA2活性增高,主要是sPLA2和cPLA2。4. Variabilin在体内可抑制血清和胰腺细胞内PLA2活性,对胰腺创伤大鼠模型有良好的保护作用。