牧草盲蝽对三氟氯氰菊酯的抗药性及生理生化与分子机制

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zydolphin
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牧草盲蝽Lygus pratensis Linnaeus(半翅目:盲蝽科)是我国西北地区重要的多食性害虫之一。近年来,随着我国北方农牧交错带紫花苜蓿的集约化种植和作物品种轮作的增加,使牧草盲蝽的发生和危害程度加重,农产品产量和品质下降。本文监测了牧草盲蝽对5种常用杀虫剂的抗药性水平,并在室内开展了牧草盲蝽对三氟氯氰菊酯抗性品系选育、风险评估及抗性机理的研究。研究结果可为牧草盲蝽的可持续、高效科学防控提供理论依据。1.牧草盲蝽对5种杀虫剂的抗药性监测。采用玻璃管药膜法,于2015-2019年间,在我国北方农牧交错带紫花苜蓿种植田上,监测了牧草盲蝽田间种群对辛硫磷、灭多威、三氟氯氰菊酯、吡虫啉以及阿维菌素的敏感度。除和林格尔县田间种群中未检测出对三氟氯氰菊酯的抗性外,在其他监测地抗性水平均呈逐年上升的趋势,部分地区已达到中等抗性水平;吡虫啉在托克托县的抗性水平呈逐年上升趋势,于2019年达到中等抗性水平;大多数地区种群对辛硫磷、灭多威和阿维菌素无抗性。2.牧草盲蝽对三氟氯氰菊酯的抗性品系选育、交互抗性以及风险评估。使用三氟氯氰菊酯对牧草盲蝽进行抗药性品系选育,在室内连续筛选14代,获得了一个抗性倍数达42.56倍的品系,并开展了交互抗性及抗性风险评估测定。结果显示:抗性品系对灭多威(RR=1.474)、辛硫磷(RR=2.662)、阿维菌素(RR=1.346)均无交互抗性;对吡虫啉(RR=5.203)和高效氯氰菊酯(RR=4.854)存在低水平交互抗性;与溴氰菊酯(RR=10.040)为中度交互抗性。经过对牧草盲蝽连续14代室内筛选所获得的抗性品系进行风险评估,其现实遗传力为0.339。3.不同增效剂对三氟氯氰菊酯的增效作用及P450s含量测定。使用PBO、DEF、DEM增效剂测定了敏感、抗性品系对三氟氯氰菊酯的毒力,并且采取测定血红素过氧化物酶的活力间接反映P450活力的方法,比较了敏感与抗性品系的解毒酶活性差异。与敏感品系相比,PBO对抗性品系的增效比为21.38,抗性倍数降至7.94倍,并且抗性品系的P450比活力是敏感品系的2.4倍,酶活性显著升高,表明牧草盲蝽对三氟氯氰菊酯的抗性与P450活力升高有关。同时采用q PCR技术测定了三氟氯氰菊酯抗性、敏感品系的细胞色素P450表达谱,有9个基因(CYP4C1、CYP4C3、CYP6A2、CYP6A13、CYP6A14、CYP6A20、CYP6B7、CYP6J1、CYP6K1、CYP303A1)在抗性品系中显著高表达,有7个基因(CYP4C21、CYP4V2、CYP6B3、CYP6D5、CYP9E2、CYP12、CYP305A1)4.牧草盲蝽P450 CYP6A13基因的克隆与表达谱分析。采用RT-PCR和RACE技术获得CYP6A13基因全长序列,并通过实时荧光定量PCR检测P450 CYP6A13在成虫不同性别、组织(头、胸和腹)、品系(抗性品系和敏感品系)以及不同龄期(1~5龄)若虫中的表达谱。牧草盲蝽CYP6A13基因(Gen Bank登录号:MN782520)的c DNA全长2003 bp,ORF(开放阅读框)为1503 bp,编码氨基酸500个,无跨膜区域,无信号肽,具有P450基因的保守结构及特征。在若虫期,5龄的表达量显著高于1龄;在成虫不同组织部位中,头部的表达量显著高于胸、腹部;在不同性别中,雌雄成虫体内CYP6A13基因的表达无显著差异;在三氟氯氰菊酯不同抗性品系中表达量均高于敏感品系,R14品系表达量是对照组表达量的2.11倍,差异显著(P<0.05)。将CYP6A13全长序列添加酶切位点后连接至p ET-28(+)载体上,并转化到感受态细胞中,构建得到p ET28-CYP6A13表达载体。5.牧草盲蝽钠离子通道基因的克隆及突变位点检测。采用分段PCR方法克隆获得了牧草盲蝽钠离子通道c DNA序列(Gen Bank登录号:MW821485),开放阅读框全长6072bp,编码2024个氨基酸,经过生物信息学分析,预测蛋白分子质量为228.94 k Da,等电点(p I)4.99,有多个跨膜区域,无信号肽,具有钠离子通道蛋白的保守结构和特征。同源性分析表明牧草盲蝽钠离子通道蛋白与绿盲蝽(Apolygus lucorum)的亲缘关系最近,其次为温带臭虫(Cimex lectularius)。通过测序分析,比较抗性与敏感品系的钠离子通道序列ⅡS4-ⅡS6区域,并未发现存在可能导致靶标抗性的核苷酸突变。
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