鱼类繁殖的基础是配子的形成,又称为配子发生,包括精子发生和卵子发生。配子发生是一个高度协调的过程,依赖于自分泌/旁分泌激素和生长因子的调节。然而,调控鱼类配子发生的分子机制仍然缺乏深入研究,尤其是在具有自然性逆转现象的鱼类中。本研究绘制了半滑舌鳎雄性（male）、性逆转雄性（pseudomale）和雌性（female）性腺的高分辨率单细胞转录图谱,旨在解析鱼类配子发生过程中的动态基因表达特征和伪雄鱼的精子发生机制,并揭示脊椎动物配子发生过程中保守的转录特征。主要研究内容和结果如下:1.基于单细胞测序技术解析半滑舌鳎雄鱼和伪雄鱼精子发生过程。根据已知标记基因的表达模式,从半滑舌鳎精巢中鉴定了5种生殖细胞（包括未分化的精原细胞、分化后的精原细胞、前细线期精母细胞、粗线期精母细胞和精子）和6种体细胞（包括支持细胞、间质细胞、T细胞、NKT细胞、B细胞和红细胞）。此外,对人、鼠、半滑舌鳎雄性性腺的单细胞转录组数据比较分析,发现精子发生关键基因如gfra1,spo11,sycp1,sycp3,dnajb13,tekt1和gata4等在人、鼠和半滑舌鳎精巢细胞中具有相似的表达特征。随后,本研究利用拟时序分析重建了雄鱼和伪雄鱼生殖细胞的分化过程,揭示了鱼类精子发生过程中的动态基因表达调控规律。进一步,对雄鱼和伪雄鱼精巢的单细胞转录组数据进行比较分析,发现雄鱼和伪雄鱼精巢具有相同的细胞类型,并表现出相似的基因表达模式。但是与雄鱼相比,伪雄鱼的未分化精原细胞比例较高,而分化后精原细胞和前细线期精母细胞的比例较低。从基因表达层面来看,细胞周期G1/S期基因在伪雄鱼未分化精原细胞和前细线期精母细胞中的表达水平低于雄鱼,而G2/M期基因的表达没有明显差异。参与细胞周期激活的基因（cdc45和meioc）在伪雄鱼除精子外的所有生殖细胞中表达量显著下调,而自噬体形成相关基因ykt6和凋亡促进基因znrf3在伪雄鱼分化后的精原细胞和前细线期精母细胞中显著上调。通过对雄鱼和伪雄鱼未分化精原细胞进行差异分析,发现细胞增殖和MAPK信号通路以及多个Ca SR拷贝在伪雄鱼未分化精原细胞中上调,而钙离子信号通路在伪雄鱼中下调。随后,对雄鱼和伪雄鱼生精微环境进行比较分析,发现伪雄鱼精巢中间质细胞比例显著低于雄鱼,而支持细胞比例无显著差异。通过基因表达分析发现,与雄激素合成相关的信号通路和基因（hsd3b1,cyp17a1,cyp11a1,hsd11b2和hsd17b1）在伪雄鱼间质细胞中显著下调,支持细胞功能相关信号通路在伪雄鱼支持细胞中显著下调。此外,对半滑舌鳎性染色体特异性基因在精巢细胞中的表达模式进行分析,发现Z染色体特异性基因在雄鱼精巢细胞中的表达水平高于伪雄鱼,而常染色体基因无明显差异。2.基于单细胞测序解析半滑舌鳎卵子发生过程。从半滑舌鳎卵巢组织中鉴定了三种不同发育状态的生殖细胞（早期卵原细胞、有丝分裂期卵原细胞、卵母细胞）;五种体细胞（滤泡细胞、内皮细胞、巨噬细胞、T细胞、红细胞）,并分析了各细胞类群的基因表达特征。通过拟时序分析重现了鱼类卵子发生的时间进程,发现早期卵原细胞、有丝分裂卵原细胞和卵母细胞遵循连续的发育轨迹,而许多卵原干细胞标记物,有丝分裂相关基因以及减数分裂相关基因在拟时序轨迹的不同阶段富集。进一步,鉴定了四种颗粒细胞亚型（GC1,GC2,GC3和GC4）和一种膜细胞（Tc）,并揭示了每种细胞亚型的基因表达特征。对生殖细胞和体细胞亚群进行了细胞通讯分析,发现与哺乳动物卵子发生相似,鱼类生殖细胞和颗粒细胞之间存在广泛的双向相互作用,在生殖细胞和膜细胞间仅存在由生殖细胞到膜细胞的单向作用,而与卵子发生密切相关的TGF-β信号通路和Notch信号通路在半滑舌鳎卵巢中的表达模式也与哺乳动物中一致。此外,还发现排卵相关基因lhcgr,pgr,ptger4b,adamts1和ecm1在不同颗粒细胞亚型中特异表达,表明不同颗粒细胞亚型在鱼类排卵过程中的协同调控作用。最后,对半滑舌鳎和食蟹猴卵巢的单细胞转录组数据进行比较分析,发现在半滑舌鳎卵巢生殖细胞和颗粒细胞中的大多数差异表达基因都与食蟹猴同源,并且这些同源基因显著富集于与卵子发生相关的生物过程。此外,一些与卵子发生相关的同源基因,如zar1,sall4,ybx2,dnd1,meiob,gdf9,foxl2,fshr,wt1,hsd17b1,cdh1和bmpr2,在半滑舌鳎和食蟹猴卵巢细胞中表现出相似的基因表达模式。本研究结合单细胞测序技术,提供了一个全面的高分辨率鱼类性腺细胞转录图谱,解析了半滑舌鳎性腺细胞异质性,揭示了在单细胞分辨率下鱼类配子发生过程中基因表达模式的动态变化,为鱼类配子发生的深入研究提供了参考。通过雄鱼和伪雄鱼精子发生的比较分析,解析了雄鱼和伪雄鱼精子发生过程中的差异表型特征和基因表达特征。同时,鉴定了调控卵子发生的4种颗粒细胞亚型和一种卵泡膜细胞,并揭示了这些细胞亚型与生殖细胞间的相互作用,以及在排卵过程中的协同调控。结合食蟹猴卵巢单细胞转录组数据,探讨了卵子发生在脊椎动物进化中保守的转录特征。这些发现可以为半滑舌鳎的人工繁育以及全雌苗种的培育提供理论依据,同时对揭示自然界广泛存在的性逆转群体的可育机制具有重要意义。此外,有助于理解低等脊椎动物生殖策略的适应性和脊椎动物配子发生的共同规律,为鱼类繁殖生物学的相关研究提供理论参考。