论文部分内容阅读
第一部分消退素D1通过降低Smad2/3磷酸化水平抑制机械牵张导致的上皮间质转分化目的:机械牵张能导致肺纤维化,对ARDS病人高死亡率有重要影响,消退素D1(Rv D1)具有潜在的促炎症消退的作用。本研究旨在探讨消退素D1在机械牵张导致的人肺上皮细胞(BEAS-2B)的EMT过程中可能存在的作用及相关机制。方法:本实验以人肺上皮细胞(BEAS-2B)为主要研究对象。牵张前对体外培养的BEAS-2B细胞用40 m M HCl进行预刺激(培养液PH=4.0)10min,对照组用PBS溶液培养10 min。细胞处理后,应用FX-5000细胞牵张系统,牵张幅度为20%,48h,频率0.33Hz。实验分组:(1)对照组(2)HCl组(3)PBS+牵张组(4)HCl+牵张组。相差显微镜观察细胞形态变化,western blot检测E-Cadherin、α-SMA、Vimentin蛋白的变化。应用不同浓度的Rv D1和Rv D1的抑制剂BOC-2处理BEAS-2B细胞,western blot和免疫荧光观察上述指标的变化。接着使用ALK-5抑制剂A8301处理BEAS-2B细胞后施加20%牵张应力48h,western blot观察Smad2/3和Slug的激活情况,ELISA观察TGF-β1表达情况。结果:1.BEAS-2B细胞受到HCl预处理后行20%牵张48h后观察到细胞形态从鹅卵圆形变成长梭形,细胞失去极性,细胞间隙也明显增宽;与对照组相比,E-Cadherin蛋白表达下降,α-SMA、Vimentin表达升高。2.低浓度的Rv D1对BEAS-2B细胞EMT无影响,中浓度的Rv D1明显抑制BEAS-2B细胞发生EMT,高浓度的Rv D1对BEAS-2B细胞EMT相关指标变化不明显,差异无统计学意义。3.予以Rv D1的抑制剂BOC-2后,可部分逆转Rv D1对BEAS-2B细胞EMT的作用。4.ALK-5抑制剂A8301处理BEAS-2B细胞后,Smad2/3和Slug激活受到抑制,TGF-β1表达水平下调。结论:Rv D1处理可通过抑制Smad2/3磷酸化水平减轻过度牵张诱导的BEAS-2B细胞EMT变化。第二部分消退素D1通过抑制肺上皮细胞EMT减轻机械通气导致的小鼠肺纤维化目的:上皮间质转分化在肺纤维化过程中起着重要作用,从在体水平探讨消退素D1在抑制机械通气相关肺纤维化中的作用及可能存在的机制。方法:采用SPF级别雄性C57小鼠24只,6-8周龄,体重20-23g,随机分成4组,每组6只,气管内滴注HCl(p H 1.2,2 ml/kg),同时用PBS处理作为对照。24h后行机械通气,吸气峰压(PIP)22 cm H2O,PEEP 2 cm H2O,呼吸频率(RR)120次/分,2h。拔管后观察14天。实验分组:(1)对照组(2)HCl组(3)通气组(MV)(4)HCl+通气(MV)组。HE染色和Masson染色观察小鼠肺组织结构变化并判断肺纤维化程度。检测肺组织中Collagen-1、羟脯氨酸的含量变化及肺泡灌洗液中TGF-β1的变化。Western blot检测肺组织中E-Cadherin、α-SMA、Vimentin蛋白的变化。随后观察不同剂量的Rv D1以及Rv D1的抑制剂BOC-2对小鼠肺纤维化的影响,western blot和免疫荧光观察上述指标的变化。ALK-5抑制剂A8301处理对小鼠肺纤维化的影响,western blot观察Smad2/3和Slug的蛋白变化情况。结果:1.气管内滴注HCl 24h后行机械通气,HE染色和Masson染色显示与对照组相比,HCl+MV组中肺组织结构被破坏,肺间隔明显增厚并出现肺纤维化改变。肺纤维化评分、肺组织中Collagen-1、羟脯氨酸的含量及肺泡灌洗液中TGF-β1含量明显增高,上皮标志物E-Cadherin表达较对照组明显下调,Vimentin表达明显上调,α-SMA无明显变化。2.不同剂量的Rv D1可以减轻肺纤维化程度,但低剂量和高剂量的Rv D1对肺组织中羟脯氨酸含量无明显降低,E-Cadherin无明显表达上调。3.予以Rv D1的抑制剂BOC-2后,可部分逆转Rv D1减轻小鼠肺纤维化的作用。4.ALK-5抑制剂A8301处理后肺纤维化程度减轻,Smad2/3和Slug磷酸化水平下调。结论:消退素D1通过抑制肺上皮细胞EMT减轻机械通气导致的小鼠肺纤维化。