目的卵巢癌是常见的女性生殖系统肿瘤,与宫颈癌、子宫内膜癌并称为妇科三大恶性肿瘤。因卵巢位于盆腔底部,卵巢癌患者缺乏特异性的早期临床症状,并且目前也没有有效的早期诊断方法,所以三分之二的患者至确诊时已届晚期。尽管已有转移的患者在经历了肿瘤细胞减灭术及以铂类药物为基础的化疗后有所好转,但90%的患者极易复发,因此预后差,其死亡率位居妇科恶性肿瘤的首位。近三十年来,卵巢癌患者5年存活率并无大的改善,仅为20-30%。因卵巢组织成分非常复杂,因而不同类型的原发性卵巢癌的组织学结构及生物学行为存在很大差异。其中浆液性囊腺癌是卵巢上皮性恶性肿瘤中最常见的组织类型,约占卵巢恶性肿瘤的40-50%。近年来,随着肿瘤生物学、分子生物学、免疫学的发展,如何早期发现卵巢癌并利用生物疗法治疗卵巢癌已成为人们研究的热点问题。和其他恶性肿瘤一样,卵巢癌的发生也是与细胞增殖分化相关的癌基因、抑癌基因多阶段相互作用的结果。目前已发现K-ras,c-myc,c-erbB2(Her-2/neu)等癌基因的激活和P53,P16,BRCA1等抑癌基因的失活与卵巢癌的发生密切相关。程序性细胞死亡-4(Programmed cell death,PDCD4)是1995年Shibahara等在小鼠体内发现的与细胞凋亡有关的基因,近几年来的研究显示PDCD4可作为基因转录及蛋白翻译的抑制因子抑制肿瘤的生长,因而被确认为新的抑癌基因。为了阐明PDCD4在卵巢癌发生发展中的作用,并探寻PDCD4作为卵巢癌诊断、预后判断及治疗的靶基因的可能性,本研究拟从以下三方面进行研究:◆PDCD4在浆液性囊腺癌组织中的表达及其临床意义◆PDCD4对上皮性卵巢癌细胞恶性行为影响的实验研究◆超声及微泡剂介导PDCD4基因抑制裸鼠卵巢癌移植瘤生长的实验研究材料与方法一、PDCD4在浆液性囊腺癌组织中的表达及其临床意义1.临床病例标本及病历资料的收集:收集山东大学齐鲁医院、山东大学第二医院、济南市中心医院妇科2001-2007年间,年龄在35-74岁(平均53岁)之间的69例浆液性肿瘤(26例浆液性囊腺瘤、43例浆液性囊腺癌)。20例对照组正常卵巢来自山东大学齐鲁医院、山东大学第二医院、济南市中心医院妇科接受手术切除卵巢的非卵巢性疾病患者。临床及病理资料调查来自43例浆液性囊腺癌患者,生存资料来自43例浆液性囊腺癌中的32位患者,疾病特异性生存时间是从手术时至因卵巢癌死亡或至调查时。2.分别利用RT-PCR和免疫组化方法检测浆液性囊腺癌、浆液性囊腺瘤及正常卵巢组织中PDCD4 mRNA和蛋白的表达情况。3.采用卡方检验方法分析浆液性囊腺癌与正常卵巢、浆液性囊腺瘤组织中PDCD4表达的差异,采用卡方检验方法分析PDCD4表达与浆液性囊腺癌患者临床病理学特点的关系;采用Kaplan-Meier和Log-rank检验分析PDCD4表达与患者疾病特异性生存时间的关系;采用Cox回归进行多因素分析确定PDCD4表达是否为浆液性囊腺癌患者独立的预后因素,若P值小于0.05即认为差别具有统计学意义。二、PDCD4对上皮性卵巢癌细胞恶性行为影响的实验研究1.按常规培养人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3,3AO及CAO3,利用带有红色荧光的真核表达载体pDsRed2-N1(空载体)及pDsRed2-N1-PDCD4(PDCD4重组表达载体)分别转染上述细胞,并利用未转染的相应细胞作为对照;利用荧光显微镜观察、RT-PCR及Western blot技术检测转染的效果。对于SKOV3细胞,利用300μg/mL的G418筛选转染阳性的克隆,建立稳定转染PDCD4重组表达载体及空载体的细胞系,分别命名为SKOV3-PDCD4及SKOV3-MOCK。2.利用活细胞计数法检测PDCD4重组表达载体转染后,PDCD4对卵巢癌细胞增殖的影响;利用平板集落形成实验检测PDCD4对卵巢癌细胞集落形成能力的影响。以空载体转染的细胞及未转染的细胞作为对照。3.利用稳定转染PDCD4重组表达载体及空载体的细胞系(SKOV3-PDCD4及SKOV3-MOCK)和未转染的SKOV3细胞系给裸鼠腋窝皮下荷瘤,检测PDCD4对卵巢癌细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响。4.利用流式细胞术检测PDCD4重组表达载体转染后,PDCD4对卵巢癌细胞的细胞周期及凋亡的影响;利用Hochest凋亡检测试剂盒进一步检测PDCD4重组表达载体转染后,PDCD4对卵巢癌细胞凋亡的影响。以空载体转染的细胞及未转染的细胞作为对照。三、超声及微泡剂介导PDCD4基因抑制裸鼠卵巢癌移植瘤生长的实验研究1.利用人卵巢癌细胞系SKOV3给裸鼠腋窝皮下荷瘤,待一周左右成瘤后,利用超声及微泡剂介导PDCD4重组表达载体瘤内注射。同时以超声+PDCD4重组表达载体、微泡+PDCD4重组表达载体、单独PDCD4重组表达载体、空载体作为对照。2.利用生长曲线、瘤体重量及病理检测,探讨超声及微泡剂介导PDCD4基因对卵巢癌细胞生长的抑制作用。结果一、PDCD4在浆液性囊腺癌组织中的表达及其临床意义1.PDCD4在浆液性囊腺癌组织中存在低表达和缺失:为了探讨PDCD4在卵巢癌发生及发展中的作用,我们首先利用RT-PCR检测了14例浆液性囊腺癌组织、2例浆液性囊腺瘤及2例正常卵巢组织中PDCD4 mRNA的表达,然后利用免疫组化的方法检测43例浆液性囊腺癌、26例浆液性囊腺瘤及20例正常卵巢组织中PDCD4蛋白的表达。RT-PCR的结果显示,57.1%(8/14)的浆液性囊腺癌组织中存在PDCD4mRNA的表达缺失或降低,2例正常卵巢、2例浆液性囊腺瘤中均表达中等或高水平的PDCD4。免疫组化的结果显示39.5%(17/43)的浆液性囊腺癌组织PDCD4表达缺失,18.6%(8/43)的组织中表达低水平的PDCD4蛋白。而浆液性囊腺瘤及正常卵巢组织中PDCD4蛋白的表达均为阳性,其中80%(21/26)的浆液性囊腺瘤及70%(14/20)的正常卵巢组织表达中等或高水平的PDCD4蛋白。2.PDCD4表达下调或缺失与浆液性囊腺癌患者高的病理级别有关:为了研究浆液性囊腺癌组织中存在PDCD4低表达或缺失的临床意义,我们进一步分析了PDCD4的表达与临床病理特征之间的关系。经x~2检验分析结果显示PDCD4的低表达或缺失与患者年龄、原发灶的部位、是否转移及临床分期无明显相关性,但与浆液性囊腺癌高的病理级别密切相关(P=0.0118)。3.PDCD4表达下调或缺失与浆液性囊腺癌患者的预后密切相关:为了探讨PDCD4的表达水平与患者预后之间的关系,我们对43例浆液性囊腺癌患者中的32例进行了追踪调查。并利用Kaplan-Meier生存曲线分析和Log-rank检验发现,PDCD4的表达水平与患者疾病特异性生存率密切相关(P=0.0011)。进一步经过Cox多因素回归分析发现,除了病理级别是疾病特异性生存率的独立预后因素外,PDCD4表达对于卵巢癌患者的生存同样是独立的预后因素(相对危险系数,0.298;95%可信区间,0.128-0.697,P=0.005)。二、PDCD4对上皮性卵巢癌细胞恶性行为影响的实验研究1.PDCD4在卵巢癌细胞系中的过表达:上述结果证实PDCD4表达的缺失仅存在于恶性卵巢肿瘤,并且PDCD4的表达状态与肿瘤的病理分级及患者预后密切相关。为了提供PDCD4抑制卵巢癌细胞增殖的直接证据,我们选择了三种低表达内源性PDCD4的卵巢癌细胞系SKOV3,3AO及CAOV3,并在脂质体介导下利用pDsRed2-N1空载体及含有全长PDCD4 cDNA的PDCD4重组表达载体pDsRed2-N1-PDCD4转染SKOV3,3AO及CAOV3细胞。利用G418筛选建立了稳定转染PDCD4重组表达载体及空载体的SKOV3细胞系,分别命名为SKOV3-PDCD4及SKOV3-MOCK。结果显示,在荧光显微镜下,SKOV3-PDCD4及SKOV3-MOCK细胞可见明显的红色荧光,而未转染的SKOV3细胞则未见荧光。RT-PCR和Western blot的结果显示,与未转染及转染空载体的相应细胞对照相比,转染PDCD4重组表达载体的SKOV3,3AO及CAOV3细胞均有很强的PDCD4的表达。2.PDCD4在卵巢癌细胞中的过表达抑制了细胞的增殖能力及克隆形成能力:转染PDCD4重组表达载体后,我们进一步探讨了PDCD4对卵巢癌细胞增殖的影响。结果显示,与对照细胞(SKOV3及SKOV3-MOCK)相比,SKOV3-PDCD4细胞的生长明显缓慢(P＜0.001)。此外,与SKOV3-MOCK细胞相比,SKOV3-PDCD4细胞的克隆形成数减少了将近50%(P＜0.01)。在其他两种卵巢癌细胞系3AO和CAOV3中得到了相似的结果。转染PDCD4重组表达载体的3AO和CAOV3细胞的增殖及克隆形成能力也明显低于相应的对照细胞(P＜0.01)。3.PDCD4在卵巢癌细胞中的过表达降低了其在裸鼠体内的成瘤能力:为了确定PDCD4在体内对卵巢癌细胞增殖的影响,我们分别利用SKOV3,SKOV3-MOCK及SKOV3-PDCD4细胞给裸鼠腋窝皮下注射。SKOV3(n=4)及SKOV3-MOCK(n=8)组的裸鼠在接种后6-7天都可在腋下触及包块且生长迅速。相反,在接种后3周内,SKOV3-PDCD4(n=8)组裸鼠均无明显的肿块形成的迹象,至3周后,仅有其中的两只裸鼠腋下长出很小的肿块。并且SKOV3-PDCD4组瘤体的平均体积及重量均明显小于SKOV3及SKOV3-MOCK组(P＜0.05)。此外,免疫组化的结果显示,与SKOV3及SKOV3-MOCK组相比,在SKOV3-PDCD4组的瘤体中可见明显的PDCD4的表达。4.PDCD4在卵巢癌细胞中的过表达诱导了细胞周期的阻滞及细胞的凋亡:为了探讨PDCD4抑制细胞增殖的机制,我们利用流式细胞术分析探讨了PDCD4对细胞周期进程及细胞凋亡的影响。结果显示,PDCD4在三种卵巢癌细胞系(SKOV3,3AO及CAOV3)中的过表达可通过增加G2或S期的细胞数目诱导细胞周期的阻滞。此外,PDCD4还可增加Sub-G1期中亚二倍体的细胞(凋亡细胞)的数目,提示PDCD4可诱导卵巢癌细胞的凋亡。为了证实这一结论,我们利用Hochest染色的方法,探讨了PDCD4对于SKOV3细胞凋亡的影响。Hochest染色后形态学的结果显示在SKOV3-PDCD4细胞的核内可见明显的染色体浓缩的现象,并有凋亡小体的形成,然而在对照细胞SKOV3及SKOV3-MOCK中却极少出现。三、超声及微泡剂介导PDCD4基因抑制裸鼠卵巢癌移植瘤生长的实验研究1.裸鼠卵巢癌移植瘤动物模型的建立:为了探讨利用超声及微泡剂介导PDCD4基因治疗卵巢癌的可能性,我们利用SKOV3细胞给裸鼠腋窝皮下注射,接种后6-7天,所有裸鼠均在腋下成瘤,成瘤率为100%,瘤体体积大约在0.1cm~3左右。2.超声及微泡剂介导PDCD4对卵巢癌细胞生长的抑制效应:裸鼠成瘤后,将其随机分为以下五组:超声+微泡+PDCD4重组表达载体(瘤内注射微泡剂+PDCD4重组表达载体并辅以超声照射)组、超声+PDCD4重组表达载体组(瘤内注射PDCD4重组表达载体并辅以超声)、微泡+PDCD4重组表达载体组(瘤内注射微泡剂+PDCD4重组表达载体)、单独PDCD4重组表达载体组(瘤内注射PDCD4重组表达载体)及单独空载体组(瘤内注射空载体)。上述五组按照各自的处理,每四天注射一次,共四次。至结束治疗后一周,处死裸鼠,取出瘤体及部分重要脏器,包括肝、肾、卵巢及子宫。结果显示,与单独注射空载体相比,其余四组瘤体体积及重量均明显降低(P＜0.05)。与单独PDCD4重组表达载体组、超声+PDCD4重组表达载体组及微泡+PDCD4重组表达载体组相比,超声+微泡+PDCD4重组表达载体组的瘤体体积及重量也有所降低,但无明显统计学意义。病理结果显示,与单独注射空载体相比,其余四组瘤体出现明显的变性和坏死,但各组间部分重要脏器的病理检测无明显差别。结论1.PDCD4在浆液性囊腺癌组织中存在低表达,甚至缺失,且与肿瘤组织的病理分级及患者的预后密切相关,并且是除病理分级之外浆液性囊腺癌患者独立的预后因素。2.PDCD4可通过诱导细胞周期阻滞及凋亡抑制卵巢癌细胞的增殖能力、克隆形成能力及在裸鼠体内的成瘤能力。3.利用超声及微泡剂介导PDCD4真核表达载体瘤内注射可抑制荷瘤裸鼠体内卵巢癌细胞的生长。创新性和意义本研究的创新性及意义主要体现在以下两个方面:1.首次研究了PDCD4在浆液性囊腺癌组织中的表达及临床意义,证实了PDCD4在浆液性囊腺癌组织中存在低表达,甚至缺失,且与肿瘤组织的病理分级及患者的预后密切相关,为浆液性囊腺癌的诊断及预后的判定提供了一种新的方法。2.首次在体内外探讨了PDCD4对上皮性卵巢癌细胞恶性行为的影响及其机制,初步证实了PDCD4可通过诱导细胞周期阻滞及凋亡抑制卵巢癌细胞的增殖能力、克隆形成能力及在裸鼠体内的成瘤能力。并利用超声及微泡剂介导PDCD4真核表达载体瘤内注射探讨了PDCD4对卵巢癌细胞生长的抑制作用,为将来卵巢癌的治疗提供了新的策略。研究的局限性1.因卵巢癌的组织类型极为复杂,故在本论文中主要研究的是在临床上极为常见的浆液性囊腺癌。PDCD4在其他类型的卵巢癌中的作用及其机制还有待于进一步的研究。2.尽管在本论文中我们利用超声及微泡剂介导PDCD4真核表达载体瘤内注射探讨了PDCD4对卵巢癌细胞生长的抑制作用,但其具体的作用及其机制还有待于进一步研究。