【摘 要】
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本文以新鲜葡萄(Vitis vinifera Linn.)的果皮为材料,对白藜芦醇合酶(RS)分离纯化方案及其主要生化信息进行了研究与探讨。实验显示:(1)应用正交实验方法筛选出RS的抽提方案:提取固液比
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本文以新鲜葡萄(Vitis vinifera Linn.)的果皮为材料,对白藜芦醇合酶(RS)分离纯化方案及其主要生化信息进行了研究与探讨。实验显示:(1)应用正交实验方法筛选出RS的抽提方案:提取固液比(g/ml)为1:2,4℃下用0.1M磷酸盐缓冲液(PH=7.5,含5mM巯基乙醇)抽提12小时后,20000g,4℃离心15分钟得到粗酶液。(2)以蛋白质分离纯化的基本策略为基础设计RS的纯化程序是:先后用65%、90%饱和度进行硫酸铵分级沉淀;透析脱盐后依次进行DEAE-cellulose 52离子交换层析和羟基磷灰石吸附层析,平衡液均为缓冲液D(0.01M磷酸盐缓冲液,PH=7.5,含1mM巯基乙醇),用0.01—0.1M磷酸盐缓冲液(PH=7.5,分别含1mM、5mM巯基乙醇)进行梯度洗脱,两次层析的洗脱液流速分别为0.6ml/min、1.2ml/min。经过该程序后RS的电泳、层析图谱分别显示一条带、一个峰;RS的比活力由0.35U/mg上升至36.4U/mg,纯化倍数由最初设定的1.0增至104。(3)凝胶过滤法测得RS的相对分子质量为87000D;RS在中性稍偏碱性环境下活力较高,其最适PH值为7.5;两种底物香豆酰辅酶A、丙二酰辅酶A的Km、Vmax值分别为1.93μM,4.84μM/min和9.8μM,4.95μM/min,由此可知香豆酰辅酶A为RS的最适底物;两种底物的V-[S]曲线均接近于米氏酶的曲线,可初步判断RS为米氏酶。(4)利用生物学分析软件、数据库和网络资源对RS的生物信息分析结果:RS具有Chalstilsynt和ChalstilsyntC两个结构域;五种葡萄属源的RS氨基酸序列间具有95%以上的同源性,得到了葡萄属RS的保守氨基酸序列;并根据这些制作得到RS的三维结构图谱;RS在植物细胞中的细胞核、线粒体基质空间、微体(过氧化物酶体)、叶绿体类囊体膜中的分布概率分别为:88%、36%、31.3%、28%。
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