调节性T淋巴细胞(regulatory T cell, Treg)是一类具有免疫抑制作用的淋巴细胞亚群,占正常人外周血中CD4+T淋巴细胞亚群的5-10%。研究资料显示,包括胃癌在内多种肿瘤患者的外周血及肿瘤组织中Treg细胞增多,其水平高低与肿瘤患者的预后密切相关。Treg细胞可以抑制包括CD4+T、CD8+T、NK、NKT等多种免疫细胞的肿瘤杀伤效应,是介导肿瘤免疫逃逸的关键因素,也是肿瘤免疫治疗的主要障碍之一。缺氧为实体肿瘤的普遍特征,可以通过调控关键的分子通路影响肿瘤的发生发展。近年来有研究发现汉黄芩素可阻断缺氧相关的分子通路,并可调节免疫细胞的活性,从而发挥抗肿瘤活性。结合以往研究,我们提出科研假说：“缺氧促进胃癌细胞分泌TGF-β1,诱导Treg细胞的产生,介导肿瘤免疫逃逸”。为了验证此假说,首先,利用胃癌手术标本,探索胃癌组织中HIF-1α表达与Treg细胞浸润的关联性；其次,利用胃癌患者外周血标本,分析手术前后TGF-β1及Treg细胞的变化；然后,基于体外细胞试验,分析缺氧对胃癌细胞分泌TGF-β1的影响,及其诱导生成Treg细胞的能力；最后,基于体外细胞试验,初步探索汉黄芩素对胃癌细胞分泌TGF-β1及诱导Treg细胞的影响。从临床角度而言,相关问题的探讨有助于对肿瘤免疫逃逸机制的深入认识,有望为肿瘤免疫治疗提供新的靶点,并有助于阐明汉黄芩素抗肿瘤活性的机制。研究内容分为4部分：1.胃癌组织中Foxp3及HIF-1α表达的关联性及其与临床病理特征的关系目的：分析胃癌患者肿瘤组织中Foxp3及HIF-1α表达的关联性,探索两者与胃癌患者临床病理特征的关系,并明确其对预后的预测作用。方法：免疫组化法检测99例胃癌患者的手术切除肿瘤标本中Foxp3及HIF-1α表达,并分别进行Foxp3+Treg细胞计数和HIF-1α表达评分,并以免疫组化双染检测胃癌组织中Foxp3及HIF-1α共表达情况结果：胃癌组织中Foxp3在Treg细胞核中染色,HIF-1α主要着色于肿瘤细胞核内及部分细胞浆内,偶见于肿瘤组内淋巴细胞着色。统计学分析发现：胃癌组织中Foxp3+Treg细胞计数及HIF-1α评分均高于癌旁组织；胃癌组织中Foxp3及HIF-1α表达具有相关性；肿瘤的浸润深度、临床分期及淋巴结转移与HIF-1α表达相关,肿瘤临床分期及淋巴结转移与Foxp3表达相关；Foxp3和HIF-1α高表达的患者总生存期明显降低。免疫组化双染发现Foxp3+Treg细胞多聚集在高表达HIF-1α的肿瘤缺氧区域,而高表达HIF-1α的胃癌细胞多同时高表达TGF-β1。结论：胃癌组织中HIF-1α表达与Treg细胞浸润具有关联性,且两者与胃癌患者恶性临床病理特征及不良预后相关。胃癌组织中Treg细胞多在表达HIF-1α的肿瘤缺氧区域浸润,肿瘤缺氧及TGF-β1高表达可能促进肿瘤组织中Treg细胞的浸润。2.手术切除肿瘤前后胃癌患者外周血Treg细胞和TGF-β1水平变化目的：探索肿瘤负荷对Treg细胞频率和TGF-β1水平的影响,并进一步分析外周血中Treg细胞和TGF-β1水平的关联性,为证实TGF-β1连接肿瘤缺氧和Treg细胞的桥梁作用提供依据。方法：2012年7月至2012年12月,采集28例胃癌患者手术前及手术后10天外周血标本,以流式细胞术检测外周血中Treg细胞比例,以ELISA法检测外周血中TGF-β1水平。结果：胃癌患者外周血中Treg细胞比例较高与合并淋巴结转移有关,而TGF-β1水平较高与低分化肿瘤病理分型有关。术前胃癌患者外周血中Treg细胞比例与TGF-β1浓度呈正相关。切除肿瘤10天后,患者外周血TGF-β1浓度及Treg细胞比例均较术前明显下降。结论：胃癌患者的外周血Treg细胞比例与TGF-β1浓度具有一定的相关性,两者水平与患者的恶性临床病理特征相关。手术切除肿瘤可降低胃癌患者外周血Treg细胞比例与TGF-β1水平,提示肿瘤负荷对机体免疫特征有影响。3.缺氧致胃癌细胞高表达TGF-β1而诱导Treg细胞目的：体外观察缺氧培养的胃癌细胞培养上清对Treg细胞的趋化和扩增作用,观察缺氧对胃癌细胞表达TGF-β1的影响,证实缺氧致胃癌细胞TGF-β1高表达可诱导Treg细胞生成。方法：分别在缺氧及常氧条件下培养胃癌细胞株AG、BGC823,以其培养上清制备条件培养基,以Transwell试验观察条件培养基对Treg细胞的趋化能力,建立共培养体系观察条件培养基对Treg细胞扩增的影响。以RT-PCR、ELISA及免疫荧光方法检测缺氧及常氧条件下培养的胃癌细胞TGF-β1表达情况。分别使用TGF-Preceptor I磷酸化酶抑制剂、recombinant TGF-β1及各种条件培养基培养磁珠分选的1CD4+CD25T细胞72小时,流式检测Foxp3+Treg细胞的比例。结果：趋化实验结果显示,Normoxic组较Control组Foxp3+Treg细胞的比例明显提高,而Hypoxic组较Normoxic组Treg细胞的比例没有显著性差异。共培养实验结果发现,Normoxic组及Hypoxic组Treg细胞的比例均较Control组明显提高,Hypoxic组与Normoxic组比较,Treg细胞的比例也有显著性升高。将胃癌细胞株AGS、BGC823分别在缺氧及常氧条件下培养,以RT-PCR、ELISA及免疫荧光方法检测TGF-pl表达,发现二种胃癌细胞的Hypoxic组均较Normoxic组胃癌细胞TGF-β1表达水平升高。以AGS的细胞培养上清作为条件培养基,用以培养磁珠分选得来的CD4+CD25-T细胞72h,流式检测Treg细胞比例,结果发现Normoxic组及Hypoxic组中Treg细胞的比例均较Control组明显提高,Hypoxic组较Normoxic组Treg细胞比例升高更为明显,而应用TGF-β1受体阻滞剂可部分阻断这种诱导作用。结论：胃癌细胞培养上清对Treg细胞有扩增作用及趋化作用。缺氧可增强胃癌细胞培养上清对Treg细胞的诱导转化,而对其趋化能力无明显影响。缺氧可导致胃癌细胞高表达TGF-β1,后者是诱导Treg细胞生成的关键因子。4.汉黄芩素对胃癌细胞分泌TGF-β1及诱导Treg细胞的影响目的：体外观察汉黄芩素对胃癌细胞分泌TGF-β1的影响,明确汉黄芩素是否可抑制幼稚T细胞向Treg细胞的转化。方法：分别在缺氧及常氧条件下培养胃癌细胞株AGS、BGC823,并在其培养体系中加入汉黄芩素,以ELISA法检测胃癌细胞培养上清中TGF-β1的浓度。以胃癌细胞培养上清制备条件培养基,分别培养磁珠分选的CD4+CD25-T细胞72小时,流式检测Foxp3+Treg细胞的比例。结果：常氧条件下汉黄芩素对AGS细胞分泌TGF-β1无明显抑制作用,而对BGC823细胞分泌TGF-β1有抑制作用,缺氧条件下汉黄芩素对AGS细胞和BGC823分泌TGF-β1均有抑制作用。以常氧培养的AGS细胞培养上清为条件培养基,汉黄芩素组与溶媒组CD4+Foxp3+T细胞比例无明显差异；以缺氧培养的AGS细胞培养上清为条件培养基,汉黄芩素组较溶媒组CD4+Foxp3+T细胞比例明显降低。结论：汉黄芩素可抑制缺氧导致的胃癌细胞TGF-β1高表达,并可抑制其诱导Treg细胞的能力。综上所述,本研究初步探索缺氧对胃癌肿瘤免疫调控的影响,证实缺氧可导致胃癌细胞分泌TGF-β1,后者可诱导CD4+CD25-T细胞向具有负向免疫调节作用的Treg细胞转换,而Treg细胞可抑制抗肿瘤免疫效应,与胃癌恶性临床病理特征和不良预后相关。本研究证实TGF-β1起到连接肿瘤缺氧与Treg细胞的桥梁作用,作为胃癌治疗的潜在靶点具有重要意义。初步的探索证实汉黄芩素可抑制缺氧导致的胃癌细胞TGF-β1高表达,并进一步抑制其诱导Treg细胞的能力。