研究背景世界范围内,膀胱癌位列男性最常见实体瘤的第四位,在女性位列第七位,每年新诊断的膀胱癌患者超过350000名。在我国,膀胱癌目前仍是最常见的泌尿系统恶性肿瘤,在泌尿系统肿瘤11,其发病率和死亡率均居首位。近几年我国部分城市膀胱癌的发病率呈现稳中有升的趋势。国内大城市中如北京,上海,天津,膀胱癌的发病率已位列男性常见恶性肿瘤的第六位,而死亡率位列第七位。膀胱癌90%以上的患者为移行细胞癌(transition cell carcinoma of the bladder TCC),其中约75%为表浅膀胱癌(superficial bladder cancer SBC),即局限于膀胱粘膜固有层的膀胱肿瘤。目前的主要治疗方法是经尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral resection of bladder tumor TCRBT),2/3病例会在术后5年内复发,并出现肿瘤分期的进展,因此术后常规辅以膀胱灌注治疗来预防复发。目前,灌注药物多采用化学药物丝裂霉素(MMC)、表柔吡星(ADM)等,膀胱灌注化疗虽然在表浅膀胱癌的术后治疗中起到了重要作用,但由于部分肿瘤出现化疗耐药性及对化疗药物的不敏感,对于此类肿瘤,探寻新的治疗方法是研究的重点。生物治疗即通过借助生物制剂的作用调动机体的防御机制,以调节机体的生物学反应,从而抑制或阻止肿瘤生长成为第四种疗法。而生物免疫制剂卡介苗(BCG)在临床研究表明仍有30%-40%无应答,在治疗有效的病例中,其副作用又进一步制约了其更为广泛的应用。因此,寻找其它免疫制剂在预防肿瘤的复发,已成为人们关注的重点。近年来大量的临床研究证明,干扰素(IFN-α、FN-γ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞介素2(IL2)等进行膀胱灌注治疗,取得了一定的效果。但是,这些细胞因子在体内常因半衰期短,病灶周围有效浓度难以长时间维持,而降低了其抗肿瘤效果。本研究所利用了一种新的蛋白质锚定技术,该技术的主要原理为：充分利用了细胞表面蛋白质的氨基易生物素化以及生物素与链亲和素高效而强有力几乎不可逆的结合这两个特性。利用这个蛋白质锚定技术平台,可在表浅膀胱癌细胞进行快速表面修饰,使免疫刺激因子迅速地锚定在细胞的表面、并能使这些已锚定的细胞因子仍保持其生物活性,延缓其代谢的速度,提高肿瘤局部组织中细胞因子浓度,刺激机体的抗肿瘤免疫反应。白细胞介素7(IL-7)于1988年发现,由骨髓基质细胞产生,靶细胞主要为淋巴细胞,对B祖细胞、胸腺细胞及外周成熟T细胞等,均有促生长活性,并调节淋巴细胞和巨噬细胞的分化、增殖、活化。主要生物学功能包括促进前B细胞的增殖,刺激活化T细胞增殖,调节胸腺DN细胞的分化,诱导巨噬细胞成熟,促进CTL和LAK增殖,分化并增强其杀伤活性。在骨髓移植后给予IL-7和干细胞因子(stem cell factor, SCF)的联合治疗,能加速骨髓来源的淋巴祖细胞再生和免疫功能的恢复。多项研究证实,IL-7具有抗肿瘤作用。白细胞介素21(IL-21)于2000年发现,属于IL-2超家族,主要由活化的CD4+T细胞分泌,调节B细胞、T细胞、NK细胞和树突状细胞的增殖和分化。主要生物学功能包括在抗CD3单克隆抗体协同刺激下促进T细胞的增殖分化,刺激NK细胞的增殖分化,通过增强IgG抗体应答反应、抑制IgE合成来调节正常的体液免疫,通过调节CD8+T细胞和NK细胞的活性清除肿瘤细胞。研究表明,IL-21在抗肿瘤过程中,增加肿瘤侵润CD8+T细胞的数量,提高肿瘤特异性CD8+T细胞的数量,保护个体再次接受同种肿瘤的攻击。本研究将hIL7-SA与mIL21-SA双功能融合蛋白联合锚定治疗小鼠表浅膀胱癌,探求其治疗表浅膀胱癌和预防表浅膀胱癌的疗效,尤其是IL-7和IL-21联合锚定是否有协同效应。本研究分为两部分开展：第一部分：hIL7-SA与mIL21-SA双功能融合蛋白的表达、纯化、复性及鉴定1、研究目的制备hIL7-SA与mIL21-SA双功能融合蛋白,并在体外研究两者生物学活性。2、研究方法1)将原核表达载体hIL7-SA-pET24a重组质粒(本室构建)转化入BL21(DE3)感受态细胞。筛选出最佳诱导条件(表达时间、最适温度等)。大量扩菌,收集菌体,超声破菌,提取包涵体,镍金属螯合层析柱(Ni-NTA)分离纯化,梯度法复性。同样的原理,制备mIL21-SA双功能融合蛋白。2)MTT法分别检测hIL7-SA、mIL21-SA融合蛋白对小鼠胸腺细胞的增殖。流式细胞仪分别分析hIL7-SA、mIL21-SA融合蛋白对生物素化后的MB49细胞锚定修饰率及同时锚定后的修饰率。锚定修饰后再次进行活性测定,检测锚定后hIL7-SA、mIL21-SA的活性。3、研究结果1)将原核表达载体hIL7-SA-pET24a重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞。筛选出表达工程菌最佳诱导条件,37℃, IPTG诱导4h。目的蛋白表达占总蛋白含量的15%,主要在包涵体中表达。Ni-NTA螯合层析柱分离纯化后,纯度达90%。纯化蛋白经透析复性得到有活性的融合蛋白复性后可见多聚体形成。Western blot鉴定,hIL7-SA融合蛋白复性后单体与多聚体均可与抗hIL7单克隆抗体结合发生显色反应。2)将原核表达载体mIL21-SA-pET21重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞。筛选出表达工程菌最佳诱导条件,37℃,IPTG诱导4h。目的蛋白表达占总蛋白含量的30%,主要在包涵体中表达。Ni-NTA螯合层析柱分离纯化后,纯度达95%。纯化蛋白经透析复性得到有活性的融合蛋白复性后可见多聚体形成。Wetern blot鉴定,mIL21-SA融合蛋白复性后单体与多聚体均可与大鼠抗小鼠IL21单克隆抗体结合发生显色反应。3)hIL7-SA融合蛋白能高效锚定于生物素化后的肿瘤细胞表面,锚定率达99.10%。hIL7-SA融合蛋白可促进小鼠胸腺细胞增殖,且成剂量依赖关系,与IL7标准品对照组间活性无统计学差异,t=0.107,P=0.916。hIL7-SA融合蛋白的活性为1×106U/mg。4)mIL21-SA融合蛋白能高效锚定于生物素化后的肿瘤细胞表面,锚定率达98.74%。融合蛋白可促进小鼠胸腺细胞增殖,成剂量依赖关系,与mIL21标准品对照组间活性无统计学差异,t=0.025,P=0.980。mIL21-SA融合蛋白的活性为1×104U/mg。5)hIL7-SA、mIL21-SA融合蛋白能同时锚定于生物素化后的肿瘤细胞表面,锚定率为97.69%。锚定后反复冻融使细胞破碎,检测与SA-GFP组间活性有显著性差异,t=4.418,P=0.003。4、研究结论1)成功制备了hIL7-SA双功能融合蛋白,即既具备hIL7的活性又能与生物素化的肿瘤细胞结合。2)成功制备了mIL21-SA双功能融合蛋白,即既具备mIL21的活性又能与生物素化的肿瘤细胞结合。第二部分：hIL7-SA与mIL21-SA双功能融合蛋白联合锚定治疗小鼠膀胱癌的实验研究1、研究目的在成功构建小鼠MB49正为表浅膀胱癌模型的基础上,应用蛋白质锚定技术,将hIL7-SA与mIL21-SA双功能融合蛋白联合锚定在小鼠膀胱表面,观察其抗肿廇效果。2、研究方法1)取雌性C57BL/6小鼠125只,随机分成5组,每组25只,其中四组建立小鼠MB49正为膀胱癌模型,分别是PBS阴性对照组、hIL7-SA锚定治疗组、mIL21-SA锚定治疗组、hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组,最后一组为对照组。对照组,正常饲养60天后,与hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组一起接受MB49细胞膀胱灌注。2)PBS对照组、hIL7-SA锚定治疗组、mIL21-SA锚定治疗组、hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组在灌注MB49膀胱癌细胞后第二天,开始分别给与PBS.hIL7-SA.mIL21-SA.hIL7-SA与mIL21-SA膀胱灌注,每3天一次,连续6次。3)建模60天后,对hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组治疗后存活小鼠和对照组再次膀胱灌注MB49细胞,观察小鼠成瘤情况及存活时间。4)治疗的第19天,每组随机抽取五只小鼠,经尾静脉取全血100ul混匀后取100u1加入到流式检测管中。在每个流式检测管中分别加入PE-antiCD4+T和FITC-antiCD8+T各50ul(用缓冲液稀释成合适浓度),混匀后避光孵育20分钟。然后每管分别加入2ml红细胞裂解液,充分混匀后避光孵育10分钟,于室温下1000rpm离心5分钟,弃上清。用2ml缓冲液洗涤2遍,PBS重悬后上流式细胞仪检测CD4+T和CD8+T细胞的含量。5)建模60天后,取hIL7-SA锚定治疗组、mIL21-SA锚定治疗组、hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组、正常小鼠脾脏,研磨制成1×106/ml作为效应细胞备用。按100：1加入灭活的MB49细胞及终浓度为20U/ml的IL2维持生长,37℃,5%C02培养箱培养5days后,收集效应细胞,PBS洗涤2次,调整细胞浓度为1×106/ml。以1×104/ml MB49细胞为靶细胞,按效靶比1：1、25：1、50：1加入96孔板,完全培养基调整每孔体积为200μl,每孔设立3复孔,7℃,5%C02培养箱培养6h后,收集上清100μl/孔。按LDH试剂盒操作,酶标仪OD490测定。计算CTL。6)在最后一次膀胱灌注后7天,每组随机选取一只小鼠,摘取膀胱,4%甲醛溶液固定后冰冻包埋剂包埋,按操作说明用冰冻切片机制作膀胱癌组织冰冻切片。检测CD4+T.CD8+T淋巴细胞的分布情况。3、研究结果1)PBS对照组在建模第8-10天可触及膀胱小肿块,15～16天出现肉眼血尿、体重下降饮食减少等,第19天小鼠开始出现死亡；hIL7-SA锚定治疗组、mIL21-SA锚定治疗组分别于第45天、44天出现死亡；hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组于第50天出现死亡。2)观察至建模后第60天,PBS对照组已全部死亡；hIL7-SA锚定治疗组有9只小鼠存活,mIL21-SA锚定治疗组有10只小鼠存活,hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组有13只小鼠存活。PBS组存活时间与其他三组相比差异具有统计学意义(χ2=58.326,P<0.001),但hIL7-SA锚定治疗组、mIL21-SA锚定治疗组、hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组间无显著性差异(P>0.05)。对hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组存活的13只小鼠和13只正常未处理小鼠再次膀胱癌灌注MB49细胞60天后,hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组仍有8只小鼠存活,与对照组相比差异有统计学意义(χ2=1,P<0.001)。3)流式细胞仪检测小鼠原位膀胱癌治疗后外周血中CD4+T.CD8+T细胞含量后,IL7-SA锚定治疗组、mIL21-SA锚定治疗组、hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组高于PBS组。说明mIL2.hIL7能促进机体的免疫功能。hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组优于hIL7-SA.mIL21-SA单独锚定治疗组。4)将hIL7-SA锚定治疗组.mIL21一SA锚定治疗组、hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组、正常小鼠脾细胞与灭活的MB49细胞刺激后,对MB49都具有杀伤作用。结果显示在效靶比1：1、25:1、50时的杀伤率分别为正常小鼠5%、7%、8%;hIL7-SA锚定治疗组10%、21%、39%；mIL21-SA锚定治疗组10%、24%、38%：hL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组12%、27%、42%。说明通过膀胱局部锚定融合蛋白治疗膀胱癌能够增强淋巴细胞对肿瘤的杀伤,进而促进机体的免疫应答。5)利用免疫组织化学检测小鼠膀胱肿瘤内CD4+T.CD8+T淋巴细胞的分泌情况。在PBS组、肿瘤内CD4+T.CD8+T淋巴细胞很少,而相反在hIL7-SA锚定治疗组、mIL21-SA锚定治疗组、hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组可检测出较多的CD4+T.CD8+T淋巴细胞。尤其是hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗组。4、研究结论锚定治疗后,各治疗组能够有效抑制表浅膀胱癌的生长,延长小鼠生存期,发挥抗肿瘤作用,联合锚定治疗组的生存时间、肿瘤特异性淋巴细胞杀伤率均高于单独治疗组,在免疫机制探讨中,联合锚定治疗组外周血和肿瘤组织中CD4+T.CD8+T均高于单独治疗组,且联合锚定治疗组中肿瘤组织中CD4+T与mIL21-SA苗定治疗组间、CD8+T与hIL7-SA或mIL21-SA单独锚定治疗组间差异均有统计学意义。但总体上,hIL7-SA与mIL21-SA联合锚定治疗效果并不显著优于hIL7-SA或mIL21-SA单独锚定治疗,IL7与IL21的协同作用亦不显著。