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人博卡病毒(HBoV)属于细小病毒亚科博卡病毒属,单链DNA病毒,长约5.5kb,基因组含有1个启动子P5,两个polyA位点(pA)p和(pA)d,HBoV的前体mRNA通过选择性剪接及选择性polyA生成成熟的mRNA,前体mRNA的选择性polyA对病毒的感染起着重要的作用,但是调控机制仍然不清楚。已有研究报道,HBoV的non-coding RNA(ncRNA)可以调控非结构蛋白的表达并且对HBoV病毒的复制是重要的,但是ncRNA的生成机制及其它功能仍需要进一步研究。 首先构建了一个重组的HBoV感染性克隆,用于研究HBoV的选择性polyA的调控。采用3RACE和RNaseH Cleavage Assay发现,除了已经报道的近端的polyA位点(pA)p(proximal)及末端的polyA位点(pA)d(distal)以外,发现了一个新的末端的polyA位点(pA)d2。(pA)d2位于REH(right-end hairpin)的中央。不论是转染感染性克隆或者感染重组病毒,都能检测到(pA)d2的存在。序列分析发现,(pA)d2不包括典型的六核苷酸polyA信号(hexanucleotide polyadenylation signal,PAS)、上游顺式作用元件(upstream elements,USE)和下游顺式作用元件(downstream elements,DSE)。进一步的研究发现,在(pA)d2位点有效的polyA需要HBoV的非结构蛋白NS1、REH和(pA)d的顺式作用元件,并且(pA)d和(pA)d2之间的距离和序列对其形成也有重要的影响。最后证明(pA)d2处有效的polyA可以增加HBoV衣壳蛋白mRNA的转录和蛋白的翻译。 在研究3polyA选择性调控中发现ncRNA,因此利用不同类型的聚合酶对α-amanitin的敏感性不同及RNA PolⅢ抑制剂ML-60218,首次用实验证实ncRNA是由RNA PolⅢ转录生成的,并且进一步确定了它的启动子还包括TATA box,是典型的RNA PolⅢ二型启动子。最后证明ncRNA可以调控(pA)d2位点的使用。 综上所述,本研究证明博卡病毒在REH存在一个新的末端polyA信号,并且HBoV3末端的选择性polyA可以调控衣壳蛋白的表达。HBoV的小非编码ncRNA由RNA PolⅢ二型启动子转录,调控HBoV3末端选择性polyA的使用。这些结果有助于进一步了解HBoV的转录特征,对ncRNA的深入理解可能作为HBoV的抗病毒治疗的靶点,以利于抗病毒药物的研发。