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研究背景及目的:心力衰竭,是人类健康的一大威胁,有文献指出近年来因心力衰竭死亡的人数占比在持续攀升,防治任务艰巨。心肌纤维化,是急性型心肌梗死、高血压性心脏病、心肌病等各种心血管疾病在向心力衰竭发展的共同病变阶段,同时也是心力衰竭的主要病变特点。而炎症反应是驱动心肌纤维化产生的最主要原因,如何正确、有效、适时地结束炎症反应是逆转心肌纤维化的关键。TGF-β是一种促纤维化生长因子,抑制心脏经典的TGF-β/Smad炎症通路对心肌纤维化的防治有重要价值。与此同时,有研究资料表明,曲尼司特对动物胃成纤维细胞、家兔的真皮成纤维细胞等具有抑制作用,此外曲尼司特还能延缓小鼠肺纤维化的进展,这提示,曲尼司特对心肌纤维化疾病的治疗有很大可能性。然而,曲尼司特作为心肌纤维化治疗的有益效果及其机制尚未阐明。本研究探讨了曲尼司特是否能抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化,以及它可能的影响机制。方法:1.在人心脏成纤维细胞(HCF)中给予不同浓度的曲尼司特(1μM、3μM、10μM和30μM)预处理细胞,然后加入100μM血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理细胞。将上述细胞分为空白对照、AngⅡ、AngⅡ+1μM、AngⅡ+3μM、AngⅡ+10μM、AngⅡ+30μM。运用CCK-8试剂盒检测曲尼司特在上述浓度范围内是否有细胞毒性。2.为了研究曲尼司特可否抑制由诱导的HCF细胞的过度增殖和迁移。本研究利用CCK-8试剂盒检测各组的细胞活力,用细胞划痕实验测定各组细胞的迁移能力,Western blot技术检测各组细胞中迁移相关蛋白(MMP2、MMP9)的表达情况。3.为了研究曲尼司特可否抑制由AngⅡ诱导的HCF细胞的纤维化。利用Western blot技术测定上述各组细胞中细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)合成相关蛋白(胶原蛋白I、胶原蛋白III、α-SMA、纤连蛋白和结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF))的表达。同时运用免疫荧光法检测空白对照组、AngⅡ组及AngⅡ+30μM组细胞中α-SMA的表达。4.为了研究经AngⅡ诱导后S100A11的表达是否增加,以及曲尼司特能否下调S100A11的表达,本研究采用RT-q PCR和Western blot技术检测上述各组细胞中S100A11的表达。5.为了研究过表达S100A11可否逆转曲尼司特对AngⅡ诱导的HCF细胞过度增殖和迁移的抑制作用。本研究构建了S100A11的过表达质粒。用RT-q PCR和Western blot技术检测质粒过表达S100A11后,将细胞分为对照、AngⅡ、AngⅡ+曲尼司特、AngⅡ+曲尼司特+Oe-NC和AngⅡ+曲尼司特+Oe-S100A11组。用CCK-8法检测各组的细胞活力,Western blot技术检测各组细胞中迁移相关蛋白(MMP2、MMP9)的表达情况,用细胞划痕实验检测定各组细胞的迁移能力。6.为了研究过表达S100A11可否逆转曲尼司特对AngⅡ诱导的HCF细胞纤维化的抑制作用。将细胞分为对照、AngⅡ、AngⅡ+曲尼司特、AngⅡ+曲尼司特+Oe-NC和AngⅡ+曲尼司特+Oe-S100A11组。用Western blot技术检测上述各组细胞中ECM合成相关蛋白(胶原蛋白I、胶原蛋白III、α-SMA、纤连蛋白和CTGF)的表达,同时运用免疫荧光技术检测上述各组细胞中α-SMA的表达。7.最后运用Western blot技术检测TGF-β1/Smad通路相关蛋白的表达,进一步研究曲尼司特与TGF-β1/Smad通路的调节关系。结果:1.CCK-8结果显示曲尼司特在这个浓度范围内没有药物毒性。2.CCK-8结果显示,与对照组相比,给予AngⅡ后细胞活力明显增加,而曲尼司特剂量依赖性地降低细胞活力。细胞划痕实验结果表明,与对照组比较,AngⅡ组细胞迁移明显增加;而与AngⅡ组相比,不同浓度的AngⅡ+曲尼司特的细胞迁移呈剂量依赖性降低。Western blot结果显示给予AngⅡ后MMP2和MMP9的表达显着增加,而曲尼司特抑制AngⅡ对MMP2和MMP9表达的影响。3.Western blot结果显示:与对照组相比,AngⅡ组胶原蛋白I、胶原蛋白III、α-SMA、纤连蛋白和CTGF的表达明显升高。与AngⅡ组相比,AngⅡ+1μM组、AngⅡ+3μM组、AngⅡ+10μM组和AngⅡ+30μM组纤维化相关蛋白表达明显下降,其中下降趋势以AngⅡ+30μm组最为明显。免疫荧光检查结果表明:与对照组比较,AngⅡ组α-SMA表达明显升高,与AngⅡ组相比,AngⅡ+曲尼司特(30μM)组α-SMA表达受到抑制。4.RT-q PCR和Western blot结果显示:与对照组相比,AngⅡ诱导后S100A11的表达增加。与AngⅡ组相比,曲尼司特给药后S100A11的表达呈剂量依赖性下降。5.CCK-8结果显示:与AngⅡ+曲尼司特+Oe-NC组相比,AngⅡ+曲尼司特+Oe-S100A11组的细胞活力显着增加。伤口愈合实验结果显示:与AngⅡ+曲尼司特+Oe-NC组相比,AngⅡ+曲尼司特+Oe-S100A11组的细胞迁移能力显着增强。Western blot结果显示:与AngⅡ+曲尼司特+Oe-NC组相比,AngⅡ+曲尼司特+Oe-S100A11组的MMP2和MMP9蛋白的表达增加。6.Western blot结果显示:与AngⅡ+曲尼司特+Oe-NC组相比,AngⅡ+曲尼司特+Oe-S100A11组的胶原蛋白I、胶原蛋白III、α-SMA、纤连蛋白和CTGF显着增加。免疫荧光结果显示:与AngⅡ+曲尼司特+Oe-NC组相比,AngⅡ+曲尼司特+Oe-S100A11组的α-SMA表达明显升高。7.Western blot结果显示:与对照组相比,AngⅡ组TGF-β、p-Smad2和pSmad3表达升高。与AngⅡ组相比,AngⅡ+曲尼司特组TGF-β、p-Smad 2和pSmad 3的表达受到抑制。与AngⅡ+曲尼司特+Oe-NC组相比,AngⅡ+曲尼司特+Oe-S100A11组TGF-β、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达明显升高。结论:曲尼司特通过S100A11/TGF-β1/Smad通路抑制血管紧张II诱导的心肌纤维化。