前言　　 脑是重要的生命中枢器官,因遭受暴力导致的脑损伤非常常见,随着建筑业和交通业的迅猛发展,创伤性脑损伤的发生率逐年升高,已严重威胁人们的生命健康。脑挫伤在临床外伤中常见,也是在法医鉴定工作中遇到最多的损伤类型之一,推断脑挫伤时间对于刑事案件的侦查及审判具有重要意义,因此关于脑损伤的形成机制、时间推断及其程度判断应引起法医学工作者的重视。准确推断脑挫伤时间一直是法医学中的难题,至今尚未圆满解决,因此有必要进一步研究脑挫伤后的蛋白分子机理并找出相应的指标,为临床诊治和法医鉴定提供理论依据。Cdk5是神经系统重要激酶之一,与其神经元特异性激活因子p35结合后,锚定于细胞膜和细胞上,通过磷酸化包括微管相关蛋白、tau蛋白、神经丝蛋白、细胞骨架蛋白、信号分子及调节蛋白的特异性丝氨酸/苏氨酸位点,主要参与神经细胞的细胞迁移、轴突导向、胞膜转运、维持微管稳定、细胞骨架调整、酶的修饰、调节钙离子信号转导及神经递质释放。在病理条件下,如缺血、谷氨酸盐过量存在等,在钙依赖性蛋白酶(calpain)的酶切作用下,p35降解为p10和p25,与p25结合的Cdk5具有更强的激酶活性,定位也发生变化,此时Cdk5过度激活导致tau蛋白、MAP-2等过度磷酸化,破坏细胞骨架,从而导致细胞凋亡。Cdk5的作用贯穿哺乳动物生命始终,含量稳定,其蛋白激酶作用活性仅仅局限于神经系统,而p35是其神经元特异性蛋白。有研究发现,大鼠脑缺血再灌注损伤可引起Cdk5的表达量增加,因此设想在大鼠脑中度钝力打击模型中Cdk5活性可能发生变化,有必要利用脑损伤模型研究脑挫伤后Cdk5表达的时间规律性变化,为脑损伤时间推断提供参考依据。　　 材料与方法　　 雄性SD大鼠50只,体重220-250g,由中国医科大学实验动物部提供。随机分为10组,其中包括8个实验组,1个正常对照组,1个假手术组,每组5只大鼠。实验组采用吴旭等研制的大鼠脑挫伤模型制作方法,制造大鼠局灶性闭合性脑挫伤模型。乙醚吸入预麻醉,大鼠称重后,2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切开大鼠顶部头皮,在人字缝前3mm,矢状缝旁3mm处钻直径为5mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完好,采用自由落体打击装置,以30g重锤从25cm高处落下,打击暴露的脑组织;假手术组以相同的方法钻孔,但不进行打击。术后动物分笼饲养,保持垫料清洁及空气通畅。分别于伤后3h、6h、12h、24h、3d、3d、5d、10d将大鼠乙醚麻醉后脱颈椎处死。手术取出脑组织,沿冠状方向将挫伤区平均分为两部分,并对损伤周边区进行取材、修块,一份用于免疫组化染色,另一份用于Western blot检测。对照组和假手术组以同样方法取相同部位的脑组织作为对照。　　 脑组织经4%多聚甲醛固定后,水洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,制作50μm厚度切片。采用链霉素.生物素法(SP法)进行免疫组化染色,并用苏木素复染细胞核,具体步骤按照试剂盒说明书。Cdk5多克隆一抗(1:400)稀释,4℃孵育过夜。染色过程中另以一抗稀释液替代一抗,作为阴性对照。兔来源Cdk5(C-8)购自Santa Cruz Biotechnology,兔SP免疫组织化学试剂盒(SP-9001)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。　　 对用于Western blot的脑组织进行裂解、匀浆、离心、提取蛋白并进行蛋白定量,聚丙烯酰胺凝胶电泳,湿转法转印,5%脱脂牛奶封闭,一抗(1:400稀释)、二抗(1:2000稀释)孵育后,DAB显色。实验中以β-actin为内参。　　 实验结果　　 免疫组织化学染色结果:对照组及假手术组神经元胞浆中可见少量Cdk5蛋白表达,阳性染色较淡。实验组中,脑挫伤后3h、6h组挫伤周边区可见阳性细胞数逐渐增多,胞浆内Cdk5蛋白表达增多,阳性染色较深;6h、12h组阳性细胞数维持在较高水平,伤后24h组阳性细胞数达到高峰,随后3d、5d组可见阳性细胞数维持较高水平,7d、10d组基本降至基础水平,并可见阳性细胞染色较淡。　　 Western blot结果:对照组和假手术组可见少量Cdk5表达;脑挫伤后3h、6h组可见Cdk5蛋白表达增加,6h、12h组Cdk5表达维持较高水平;24h组达到高峰,随后3d组、5d组维持在较高水平,7d、10d组降至基础水平。取损伤后不同时间段条带的平均光密度值,经统计分析,差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论　　 本实验在建立大鼠局灶性闭合性脑挫伤模型的基础上,应用免疫组织化学染色、Western blot方法检测大鼠脑挫伤后Cdk5表达,结果表明:　　 1.正常大鼠脑组织中有一定量的Cdk5的表达;　　 2.Cdk5蛋白在脑挫伤后挫伤周边区随时间延长表达增多,伤后24h达到高峰,随后表达逐渐减少,7d、10d恢复到基础水平,呈单峰变化;　　 3.大鼠局灶性脑挫伤后Cdk5表达呈时间规律性变化。