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目的:研究成人原代肝细胞分离后及冻存复苏后培养过程中肝细胞凋亡情况,探讨成人原代肝细胞体外长期保存的凋亡特点。方法:选取手术切除的成人良性病变肝叶标本,采用改良胶原酶灌注分离法分离肝细胞,加用冻存保护液对肝细胞进行冻存;用血球计数板计数法对分离后及冻存复苏后的肝细胞进行计数,用台盼蓝拒染法及流式细胞仪活细胞荧光染色法(FACS)检测肝细胞活力;体外培养新鲜分离及冻存复苏后的肝细胞,分别在培养的第1d、2d、3d、5d、7d、9d采用Annexin V/PI双染色法对肝细胞进行荧光染色,通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测培养过程中肝细胞凋亡情况;在新鲜分离的肝细胞体外培养的第1d、2d、3d、5d、7d、9d天,运用细胞免疫组化技术检测肝细胞Fas表达情况。结果:1.新鲜分离与冻存复苏后的成人原代肝细胞在形态上无明显差别;2.采用改良胶原酶灌注分离法分离的肝细胞总数可达109个以上;3.用胎盘蓝拒染法、流式细胞仪活细胞荧光染色法(FACS)测定新鲜分离的成人原代肝细胞活率分别为92.7%、93.30%,加用冻存保护液冻存复苏后的肝细胞活率分别为80.6%、81.24%;4.采用Annexin V/PI双染色法检测新鲜分离培养的成人原代肝细胞,荧光显微镜观察细胞凋亡数随培养时间逐渐增多,并且在培养第3天后显著增加;5.Annexin V/PI流式细胞分析法检测新鲜分离及冻存复苏后培养过程中肝细胞的凋亡情况,随时间推移,早期凋亡率及总凋亡率逐渐增高,新鲜分离培养的肝细胞在培养前3天凋亡率增幅不明显(P>0.05),培养第3天后凋亡率增幅显著增高(P<0.05),冻存复苏后培养的肝细胞在培养第2天后凋亡率增幅显著增高(P<0.05);6.细胞免疫组化检测新鲜分离培养的肝细胞Fas表达显示,在成人原代肝细胞培养过程中,前3天Fas表达量无显著性差异(P>0.05),在培养第3天后显著升高(P<0.05)。结论:1.改良胶原酶灌注分离法分离成人原代肝细胞操作简单、耗时短,获取的肝细胞数量、纯度及活率高;2.加用冻存保护液冻存的肝细胞复苏后活率高,长期保存活性较好;3.新鲜分离及冻存复苏后的成人原代肝细胞凋亡率在体外培养的过程中逐渐升高;4.新鲜分离培养的肝细胞凋亡率及Fas表达在第3天后显著升高,冻存复苏后培养的肝细胞凋亡率第2天后显著升高,提示在此时间前培养的肝细胞适合肝细胞移植的临床应用。