论文部分内容阅读
大量研究表明生物体衰老的过程伴有表观遗传学修饰水平的变化,其中组蛋白修饰与衰老关系密切。同时有研究发现组蛋白修饰的变化能够影响干细胞的生物学行为。那么,衰老状态下是否存在表观遗传学修饰的变化,并且在骨组织中影响BMMSCs的功能从而导致了上述的骨组织衰老表型,相关机制尚不清楚。 第一部分 年轻、衰老小鼠组蛋白去乙酰化酶的表达差异及BMMSCs功能差异 目的: 在年轻、衰老小鼠多种器官及年轻、衰老小鼠来源的BMMSCs中筛选出有表达差异的组蛋白去乙酰化酶。 方法: 1)使用RT-qPCR技术在年轻、衰老小鼠多个重要器官中;在年轻、衰老小鼠来源的BMMSCs中筛选出存在基因表达差异的组蛋白去乙酰化酶,并检测其蛋白水平。 2)使用microCT检测年轻、衰老小鼠骨量;骨组织染色检测年轻、衰老小鼠衰老相关酶SA-β-gal表达水平;免疫荧光染色对比年轻、衰老小鼠髓腔内OCN的表达水平;油红O染色检测年轻、衰老小鼠髓腔内脂肪组织含量。 3)使用western blot检测年轻、衰老小鼠来源BMMSCs的衰老相关蛋白p53、p16表达量;RT-qPCR检测两种细胞中p53、p16mRNA表达水平;油红O染色检测两种细胞的成脂分化能力、茜素红染色检测两种细胞的成骨分化能力。 结果: 1)衰老小鼠心、肝、肺、骨中组蛋白去乙酰化酶HDAC9mRNA表达增加;心、肝、肺中HDAC9蛋白水平增加;衰老小鼠来源的BMMSCs中HDAC9mRNA升高,HDAC9蛋白水平增高,H3K9乙酰化水平相应降低。 2)衰老小鼠骨量下降、SA-β-gal阳性表达增加、髓腔内脂肪增多,符合骨衰老表型。 3)衰老小鼠来源BMMSCs p53、p16mRNA及蛋白表达增多,成骨分化能力减弱,成脂分化能力增强。 结论: 16月龄自然衰老小鼠具有骨衰老表型。16月龄自然衰老小鼠来源的BMMSCs衰老蛋白表达增加、成骨分化减弱、成脂分化增加,组蛋白去乙酰化酶HDAC9表达增加。 第二部分 抑制HDAC9对衰老骨髓间充质干细胞成骨/成脂分化平衡的影响 目的: 分别使用HDAC抑制剂和HDAC9siRNA干预衰老BMMSCs,检测其对细胞成骨分化、成脂分化能力的影响。 方法: 1)使用RT-qPCR分别筛选HDAC抑制剂TSA、NaB抑制HDAC9的有效浓度,并检测HDAC9、H3K9ac蛋白表达水平。 2)根据筛选出的工作浓度将TSA、NaB分别添加于BMMSCs培养基中,进行成骨诱导。使用western blot检测成骨分化相关蛋白Runx2、ALP表达量;使用茜素红染色检测细胞形成矿化结节的能力。 3)将TSA、NaB作用于BMMSCs,进行成脂诱导,用western blot检测成脂分化蛋白PPAR-γ表达量;使用油红O染色检测BMMSCs形成的脂滴数量。 4)使用HDAC9siRNA转染BMMSCs,使用RT-qPCR检测HDAC9mRNA水平、使用western blot检测HDAC9及H3K9ac蛋白含量,确认转染效率。 结果: 1)100nmol/LTSA、200μmol/LNaB能够分别抑制HDAC9mRNA水平和蛋白水平,提高H3K9位点乙酰化水平。 2)100nmol/L TSA、200μmol/L NaB在成骨诱导过程中促进衰老BMMSCs中Runx2、ALP蛋白的表达,促进衰老BMMSCs形成较多的矿化结节。 3)100nmol/L TSA、200μmol/L NaB在成脂诱导过程中抑制衰老BMMSCs中PPAR-γ蛋白的表达,抑制衰老BMMSCs形成脂滴。 4)HDAC9siRNA能够有效抑制BMMSCs HDAC9mRNA水平及蛋白水平。 5)HDAC9siRNA在成骨诱导过程中促进衰老BMMSCs中Runx2、ALP蛋白水平,利于衰老BMMSCs形成矿化结节。 6)HDAC9siRNA在成脂诱导过程中减弱衰老BMMSCsPPAR-γ蛋白量,减少衰老BMMSCs形成的脂滴数量。 结论: 使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA、NaB和HDAC9siRNA,抑制衰老BMMSCs中HDAC9表达水平,都能促进细胞成骨分化、抑制成脂分化。 第三部分 组蛋白去乙酰化酶HDAC9表观调控自噬相关基因影响骨髓间充质干细胞的成骨/成脂分化平衡 目的: 对比年轻、衰老BMMSCs的自噬水平。在衰老BMMSCs中抑制HDAC9表达后,检测自噬水平的变化。进而通过CHIP实验验证HDAC9是否以表观遗传学方式调控自噬相关基因。最后在衰老BMMSCs中干扰HDAC9表达的同时,抑制自噬功能,检测细胞的成骨/成脂分化能力,进一步证明HDAC9表观遗传学调控自噬,进而影响BMMSCs的成骨/成脂分化能力。 方法: 1)使用western blot检测年轻、衰老BMMSCs中自噬相关蛋白Beclin1、ATG7、LC3II/I、自噬作用底物P62的表达水平;使用免疫荧光染色检测年轻、衰老BMMSCs胞浆内LC3蛋白的表达量;使用透射电镜检测年轻、衰老BMMSCs胞浆内自噬体的数量。 2)使用HDAC9siRNA干扰衰老BMMSCs后,检测细胞中蛋白Beclin1、ATG7、LC3II/I、P62的表达水平;胞浆中LC3表达量;胞浆中自噬体数量。 3)采用染色质免疫共沉淀试验检测HDAC9是否能够直接结合在自噬相关基因Becn1、ATG7、LC3的启动子区域,以及这些启动子上H3K9ac的水平。 4)对衰老BMMSCs进行siHDAC9及siBECN1双转染,或TSA与siBECN1共同作用,成骨诱导后,western blot检测BMMSCs中Runx2、ALP的表达;茜素红染色检测细胞形成矿化结节能力。 5)对衰老BMMSCs进行siHDAC9及siBECN1双转染,或TSA与siBECN1共同作用,成脂诱导后,western blot检测BMMSCs中PPAR-γ的表达;油红O染色检测细胞形成脂滴的能力。 结果: 1)衰老BMMSCs自噬水平下降。 2)抑制衰老BMMSCs中的HDAC9,自噬功能有所恢复。 3)在衰老BMMSCs中抑制HDAC9后,自噬相关基因启动子上结合的HDAC9减少,同时H3K9乙酰化水平增加。 4)siHDAC9或TSA抑制HDAC9后,能够促进衰老BMMSCs的成骨分化。当使用siBECN1抑制自噬功能后,上述作用被部分阻断。 5)使用siHDAC9或TSA抑制HDAC9,能够抑制衰老BMMSCs成脂分化。当使用siBECN1抑制自噬功能后,上述作用被部分阻断。 结论: 衰老BMMSCs自噬水平降低,HDAC9表达增加。在衰老细胞中抑制HDAC9表达,能够减少其在自噬相关基因启动子区域的结合水平,促进基因转录,部分恢复细胞的自噬水平,进而部分逆转衰老BMMSCs成骨/成脂分化失衡状态。 第四部分 体内抑制HDAC9表达逆转小鼠骨衰老表型. 目的: 在衰老小鼠骨髓腔中使用慢病毒载体抑制HDAC9表达,检测骨衰老表型。分离BMMSCs体外培养,检测经抑制HDAC9后体内来源的BMMSCs成骨/成脂分化能力及衰老相关特性的变化。 方法: 1)对衰老小鼠骨髓腔注射经浓缩的下调HDAC9慢病毒载体,进行microCT检测骨量、SA-β-gal染色检测骨衰老指标,免疫荧光染色检测成骨指标OCN的表达以及油红O染色检测髓腔脂肪含量。 2)分离培养注射下调HDAC9慢病毒载体的衰老小鼠来源的BMMSCs,使用western blot检测HDAC9表达水平、自噬蛋白水平,确定慢病毒载体在BMMSCs的作用。 3)分离培养注射慢病毒载体衰老小鼠的BMMSCs,进行成骨诱导。使用western blot检测Runx2、ALP蛋白,茜素红染色检测细胞形成矿化结节的能力。 4)分离培养注射慢病毒载体衰老小鼠的BMMSCs,进行成脂诱导。使用western blot检测PPAR-γ水平、油红O染色检测细胞形成脂滴能力。 结果: 1)髓腔局部注射下调HDAC9的慢病毒载体,促进衰老小鼠骨形成及骨量恢复、减弱骨组织衰老指标表达、减少髓腔内脂肪堆积。 2)经下调HDAC9的慢病毒载体干预后,髓腔内BMMSCs HDAC9表达降低、自噬相关蛋白表达水平增加。 3)分离培养下调HDAC9的慢病毒载体干预小鼠来源的BMMSCs,western blot和茜素红染色结果表明细胞成骨分化能力增加。 4)体外培养慢病毒载体干预小鼠来源的BMMSCs,western blot和油红O染色结果表明细胞成脂分化能力降低。 5)下调HDAC9的慢病毒载体干预的小鼠来源的BMMSCs中p53、p16表达降低。 结论: 体内降低衰老BMMSCs中HDAC9表达水平,能够部分恢复细胞的自噬水平、减少细胞的衰老特性、部分逆转细胞成骨/成脂分化失衡。同时衰老小鼠骨生成增多,脂肪生成减少,骨量部分恢复。