米曲霉作为中国传统酿造的重要菌株之一,生长快速且蛋白外分泌能力强,所以常用作外源蛋白表达的优良宿主菌。而作为宿主菌的一个筛选标记来说,营养缺陷型标记基因更加高效和安全。而微流控技术可以快速产生一定尺寸和大小均一的液滴,可以很好地应用于细胞分析方面。大大减少了试剂的消耗和提高了筛选速度,我们利用微流控系统对pyrG缺陷株进行筛选,主要研究内容如下:我们搭建了微流控系统平台,选择流动聚焦型芯片产生液滴。研究不同的非离子表面活性剂对液滴稳定性的影响。用显微镜观察液滴粒径随时间的变化,通过液滴的液滴个数、归一化平均粒径、液滴粒径标准差、液滴粒径归一化标准差随时间的变化情况来判断液滴的稳定。当HLB值约为5.5时,表面活性剂体积分数为5%,液滴的稳定性在短时间较好。长时间相比,我们选择了 Abil EM90组成的油相能使液滴在10 h内保持稳定,所以选用Abil EM90作为非离子表面活性剂。接着研究油水两相流量(Q)比对液滴粒径和分布关系。当Q油/Q水比例越大时,液滴在流道中的间距越来越大,并且液滴从无间隔排列直到呈现了一条直线状分布。,随着Q油/Q水的增大,液滴粒径越来越小。当固定Q油/Q水时,增大水相的流量会发现液滴越来越大。最后我们选用了程序为Q水=0.054 mL/h,Q油=0.22 mL/h,液滴在流道中存在均一的间距,产生的液滴直径为98 μm,稳定性较高。优化DAPI对细胞核染色情况时,发现使用5%甲醛作前处理和不作前处理的条件下都可以使得染色效果良好,在UV激发光下可以观察到明亮的蓝色荧光细胞核。本次实验观察到米曲霉孢子内含有1-3个细胞核,孢子直径分布在3-7 μm左右,其中单核孢子的平均直径为3μm,两个细胞核的孢子直径为5.3 μm,三细胞核的孢子直径为7 μm。所以选择用直径为3 μm的滤膜过滤来富集单核孢子。当孢子浓度为5×105个/mL时,我们获得了较高的单细胞单分散液滴的百分比,概率约为30%,多细胞液滴百分比仅为约6%。孢子在液滴第6 h开始萌发,在第9 h后菌丝已经蔓延到了液滴的界面处,由于孢子之间存在生长状态的差异,我们选择在第9 h后对菌丝进行挑取。以米曲霉H4作为出发菌株,使用等离子诱变320秒将其诱变。通过微流控筛选后初步得到一株缺陷株命名为米曲霉G1,通过表型鉴定,基因序列比对进行鉴定。通过反式互补验证结果显示了缺陷株可以接受互补质粒恢复其原有的表型。