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立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kühn是一种死体营养型病原真菌,在玉米和水稻上引起纹枯病,造成叶片、叶鞘和茎秆上出现坏死斑,最终影响作物的质量和产量,造成重大经济损失。立枯丝核菌侵染植物过程中能够释放多种细胞壁降解酶,前人的研究表明,立枯丝核菌分泌的第45家族β-1,4内切纤维素酶EG1能够诱导烟草叶片发生过敏性坏死、活性氧迸发、Ca2+积累、细胞外碱化、胼胝质积累和防卫反应相关基因的上调表达,表现为典型的激发子功能,且其激发植物免疫的功能不依赖于EG1纤维素酶的催化活性。本研究以立枯丝核菌分泌的第45家族β-1,4内切纤维素酶EG1为研究对象,在前期已证明其可作为激发子诱导植物免疫的基础上,通过烟草瞬时表达和酵母稳定表达,确定了其激发植物免疫功能的关键区段和关键位点,并利用膜蛋白酵母双杂交筛选到在玉米体内能够与EG1发生相互作用的与谷氨酸代谢相关的转氨酶ZmGABA-T（γ-aminobutyric acid-transaminase）,解析了死体营养型病原真菌侵染植物过程中病原菌分泌的纤维素酶与植物的互作机制。主要研究结果如下:1.明确了纤维素酶EG1激发植物免疫的关键作用区段以及激发关键位点。将EG1成熟肽的N末端前60个氨基酸删除,获得截短体EG1-1经过本氏烟瞬时表达后仍然能够引起本氏烟叶片的（过敏性）坏死和活性氧迸发,在体外利用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）真核表达纯化得到的EG1-1接种到玉米叶片后同样也能够引起玉米叶片的过敏性坏死和相关防卫反应基因的上调表达。在EG1-1的基础上继续删去N末端的61-67段肽段（SPWAVND）得到的EG1-2或者删去C末端的203-206段肽段（GCSRK）得到的EG1-3通过本氏烟瞬时表达不能够引起本氏烟叶片的（过敏性）坏死,酵母体外稳定表达接种也不能引起玉米和拟南芥的过敏性坏死、活性氧迸发和防卫反应相关基因的上调表达。进一步将EG1的N末端61-67段肽段（SPWAVND）内的7个氨基酸（SPWAVND）分别进行单点突变,全部突变为丙氨酸后发现其中P62A、W63A和D87A瞬时表达既不能引起本氏烟叶片的（过敏性）坏死,稳定表达体外接种也不能引起玉米和拟南芥的过敏性坏死和防卫反应相关基因上调表达,表现为激发子功能丧失。将EG1的203-206段肽段（GCSRK）内的5个氨基酸（GCSRK）分别进行单点突变发现其激发子功能不受影响,而将其进行两两双点突变发现C204A和R206A同时突变为丙氨酸后丧失了其激发子功能,瞬时表达既不能够引起本氏烟叶片的（过敏性）坏死,体外接种稳定表达的纯酶也不能引起玉米和拟南芥叶片的过敏性坏死,其防卫反应相关基因也没有上调表达。以上结果表明,EG1激发植物产生免疫反应的关键区段包括两部分:位于N末端61-67位的SPWAVND和位于C末端203-207位的GCSRK。其关键作用位点包括:第62位的脯氨酸、第63位的色氨酸、第67位的天冬氨酸以及第204位的半胱氨酸和第206位的精氨酸,其中第204位的半胱氨酸和第206位的精氨酸不可同时缺失才能保证其激发功能正常起作用。2.明确了玉米体内与EG1互作的蛋白及其在抵抗立枯丝核菌侵染时的作用。在本氏烟体内对EG1进行亚细胞定位观察发现EG1位于植物细胞膜上,利用病毒诱导的基因沉默将本氏烟体内的模式识别受体BAK1和SOBIR1沉默后瞬时表达EG1发现仍然能够引起沉默叶片的（过敏性）坏死,表明EG1激发的植物免疫不依赖于共受体激酶BAK1和SOBIR1。利用膜蛋白酵母双杂交筛选到了一种γ-氨基丁酸转氨酶ZmGABA-T（γ-aminobutyric acid-transaminase）,其参与谷氨酸代谢过程,能够将底物γ-氨基丁酸GABA（γ-aminobutyric acid）转化成琥珀酸半醛,最终参与到三羧酸循环中。利用双分子荧光互补、免疫共沉淀等方法证明ZmGABA-T能够与纤维素酶EG1在植物体内互作,且二者能够共同定位于细胞膜上。在本氏烟体内瞬时共表达EG1与ZmGABA-T发现ZmGABA-T能够抑制EG1诱导的（过敏性）坏死和活性氧迸发。向EG1酶促反应体系中加入ZmGABA-T,对EG1进行纤维素酶活力测定发现ZmGABA-T不影响EG1酶的比活力。向培养Rhizoctonia solani AG1-IA的培养基中外源施加ZmGABA-T的底物—γ-氨基丁酸GABA检测EG1转录水平发现GABA能够抑制EG1的转录,纤维素酶活力测定发现其同样不影响EG1的酶活力。在瞬时表达ZmGABA-T的本氏烟叶片上接种Rhizoctonia solani发现立枯丝核菌侵染产生的病斑大小受到抑制,并且病原菌生物量也降低。对不同物种体内的GABA-T序列相似性进行分析比较发现其相似度较高,GABA-T序列在不同物种之间较为保守,只在N末端存在较大差异,只有水稻体内的OsGABA-T同样能够与EG1发生互作且抑制EG1引起的本氏烟叶片的（过敏性）坏死和活性氧迸发,将水稻体内的OsGABA-T利用CRISPR/Cas9技术敲除后在敲除植株叶片上接种Rhizoctonia solani发现,与野生型相比较,由立枯丝核菌侵染引起的叶片病斑长度变大且病原菌的生物量提高。以上结果表明:玉米和水稻体内的γ-氨基丁酸转氨酶GABA-T能够与纤维素酶EG1发生相互作用,GABA-T和其底物γ-氨基丁酸GABA分别通过直接促进EG1的降解和间接抑制EG1的转录两种方式在不影响EG1纤维素酶活力的前提下进而抑制EG1诱导的（过敏性）坏死和活性氧迸发从而抑制死体营养型病原真菌立枯丝核菌Rhizoctonia solani的侵染,证明参与谷氨酸代谢过程的转氨酶GABA-T也参与植物抗病过程。综上所述,我们的研究证明EG1激发植物免疫包括多个区段和不同的位点,植物体内的转氨酶能够与纤维素酶EG1互作且参与到植物的抗病过程。