研究背景：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升,40-70岁是乳腺癌的高危年龄。据统计,全世界每年约有130万人诊断为乳腺癌,50万人死于乳腺癌,乳腺癌已经成为妇女健康的最大威胁之一。乳腺癌的治疗手段目前主要有手术、放疗、化疗、内分泌治疗及分子靶向治疗等。其中,化疗在乳腺癌综合治疗中具有非常重要的地位,而蒽环类药物是被公认的治疗乳腺癌最有效的药物之一,但与其它化疗药物一样,蒽环类药物的毒副反应较大,尤其是其剂量累积性心脏毒性限制了它的应用。为解决这一问题,靶向给药方式受到高度重视,而纳米技术在靶向给药的研究中被广泛应用。纳米材料指直径在1-100nm之间的物质,在生物医学领域,稍微大一点直径的颗粒也称为纳米材料。纳米材料因其直径非常小的特点而具有区别于传统材料不同的性质特点,包括表面效应、体积效应及量子尺寸效应。纳米颗粒凭借这些独特的性质特点被广泛应用于工程、化学、生物及医学等方面。在医学肿瘤学领域,纳米材料主要作为载体来承载化疗药物、细胞因子、抗体等,对肿瘤细胞进行靶向治疗,从而提高药物疗效、减轻毒副作用、提高生物利用度。纳米药物载体主要分为以下4类：1.普通载药纳米颗粒,将药物与纳米颗粒直接高度结合,提高原本理化性质不稳定而易降解的药物的生物利用度；2.靶向定位载药纳米颗粒,其表面有肿瘤靶向配体,使药物准确地输送到肿瘤病灶,提高疗效、减少全身毒副反应；3.磁性载药纳米颗粒,其内部有氧化铁,氧化铁的超顺磁性使药物在外加磁场下达到被动靶向和MRI显像的目的；4.多功能型载药纳米颗粒,是集载药、智能释药、靶向、显像等多种功能于一体的纳米颗粒。理想的纳米材料作为药物载体需要具有以下特点：性质稳定,无毒、无刺激性,不致畸,颗粒直径小且分布窄；能够保护药物增加其稳定性；可以感应外界环境如酸碱、温度、酶及氧化还原剂等；可以连接配体并能承载多种药物；可以集载药及显像等多功能于一体。目前研究比较多的纳米材料有脂质体、超顺磁氧化铁、量子点及高分子聚合物等。聚合物又分为无机类分子和有机类分子,无机类分子包括纳米羟基磷灰石和介孔硅基材料,有机类分子分为有机小分子和高分子材料,高分子材料分为天然大分子和人工合成大分子如乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、两亲性共聚物等。高分子材料具有良好的生物相容性和可降解性能等优点,是一种非常有前景的纳米材料。脂质体,它是类似生物膜结构的双分子小囊,具有单个或多个双层磷脂膜的囊泡,其主要成分是磷脂,磷脂分子中磷酸基团具有亲水性,碳氢链具有疏水性；它免疫原性小且有较好的生物相容性；它可以使药物缓释,延长药物半衰期长及药效持续时间；因为肿瘤生长部位毛细血管的通透性增加及细胞的主动内吞,载药脂质体可以直接渗透至肿瘤部位提高药物疗效,同时避免高浓度游离药物渗透正常组织从而降低全身毒副反应。另外,超顺磁氧化铁作为最有希望的纳米颗粒被广泛研究,这主要源于其超顺磁性使纳米颗粒在外加磁场下定向移动,从而使纳米颗粒聚集于靶区并且能被核磁共振显像,达到药物靶向、示踪及监测目的。然而,单纯氧化铁纳米颗粒在水中很不稳定,一些疏水材料如油酸、聚乙二醇、普朗克尼、PLGA等可以包被氧化铁颗粒,使其生物相容性明显增加。研究者们在不断增加磁性纳米颗粒的生物相容性的同时,也在不断探索药物智能释放的方法。已有研究报道,一些纳米材料可以在外界环境如氧化还原剂、温度、PH等刺激下降解实现药物的智能释放。然而,这些研究多数停留在化学反应的水平,少数涉及细胞水平,动物水平的相关研究更是鲜有。为实现阿霉素靶向给药,我们采用阿霉素/聚酰胺@超顺磁氧化铁纳米颗粒(doxorubicine/rPAA@superparamagnetic iron oxide nanoparticles, DOX/rPAA@SPION),在动物水平,对其治疗乳腺癌的疗效、毒副反应、生物分布及MRI显像进行研究。DOX/rPAA@SPION主要有3部分组成：阿霉素(DOX),以rPAA为骨架的高分子聚合物(reducible polyamidoamine graft poly(ethylene glycol)/dodecyl amine copolymers,rPAA),超顺磁氧化铁(SPION)。由于DOX/rPAA@SPION可以在外部磁场的作用下集中于肿瘤组织,因而可达到被动靶向给药和核磁共振显像示踪监测的目的；此外rPAA含叔胺及二硫键,对酸及还原剂敏感,而肿瘤组织内酸性高、还原剂丰富,到达肿瘤部位的DOX/rPAA@SPION纳米颗粒rPAA降解释放阿霉素,杀灭肿瘤细胞,提高疗效；纳米颗粒独特的空间结构也可以降低化疗药物毒副反应及延长药物半衰期。目的：1.通过建立MDA-MB231乳腺癌裸鼠模型,探索DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒在动物水平的抑瘤效果。2.通过观察裸鼠活动状态、体重变化及对心脏、肝脏、肾脏进行HE染色,了解DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒在体内的毒副反应。3.通过对裸鼠肿瘤组织、心脏、肝脏、肾脏进行普鲁士蓝染色,检测DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒在体内分布情况。4.通过对尾静脉注射DOX/rPAA@SPION前、注射后12h及24h的荷瘤裸鼠进行MRI显像,探讨应用MRI对DOX/rPAA@SPION纳米颗粒进行显像及监测的可行性。方法：1.培养MDA-MB231乳腺癌细胞：复苏细胞,采用含10%胎牛血清的Leibovitz’s15(L-15)培养基培养,待细胞处于对数生长期时,消化细胞,计数,将5×106细胞溶解于150u1无血清L-15培养基中。2.从南方医科大学实验动物中心购买5周龄裸鼠,SPF级饲养,观察裸鼠活动、觅食、精神状态等,约1周左右裸鼠完全适应新环境。3.建立MDA-MB231裸鼠乳腺癌模型：将第1步得到的150ul MDA-MB231细胞悬液震荡混匀,注射于完全适应环境的裸鼠右侧胁肋部皮下。4.DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒的溶解及磁性验证：清洁并用75%酒精消毒细胞超声粉碎仪,将适量无菌PBS溶液移入装有DOX/rPAA@SPION纳米颗粒沉淀的容器内,探头置于PBS液面下,调节超声功率至200w,维持30mmin。待沉淀完全溶解后,置于磁场观察纳米颗粒的顺磁性。5.DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒疗效研究：待乳腺癌裸鼠肿瘤体积达50mmm3左右,将其中肿瘤大小较为一致的21只裸鼠分为3组(n=7),对照组(Control)、阿霉素组(DOX)、磁性纳米组(DOX/rPAA@SPION),分别注射生理盐水、阿霉素和DOX/rPAA@SPION纳米颗粒。具体为Control组每只裸鼠尾静脉注射200u1生理盐水,DOX组阿霉素7mg/kg,d1、d8,而DOX/rPAA@SPION组(DOX:Fe=1:10)也是阿霉素7mg/kg,dl、d8。 DOX/rPAA@SPION组裸鼠每次尾静脉注射后立即于肿瘤表面放置磁铁,并持续1.5小时。治疗期间及处死前,隔天测量肿瘤长径及短径,计算体积；治疗后24天将裸鼠处死后称重肿瘤组织,计算抑制率。6.DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒毒副反应及生物分布：治疗期间及治疗后,观察裸鼠活动、精神状态,并称体重。治疗后24天,离断颈髓法将裸鼠处死,剥离裸鼠肿瘤、心脏、肝脏、肾脏,将其置于4%多聚甲醛中固定约24h,石蜡包埋、切片、HE染色及普鲁士蓝染色。7.DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒体内MRI显像：从剩下的荷瘤裸鼠中挑选7只用于MRI显像,DOX/rPAA@SPION颗粒中DOX:Fe=1:10。分别在注射DOX/rPAA@SPION纳米颗粒(Fe70mg/kg,相当于阿霉素一次治疗量)前、注射后12h及注射后24h,采用1%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉裸鼠,剂量为70mg/kg,待裸鼠麻醉完全,将其固定,进行MRI显像。MRI成像参数：1.5T飞利浦,冠状位,横断面,T2-加权TSE (TR/TE=3500/120ms,FOV=170,68,17mm, matrix=260×157, NEX=4, thickness/interval=2/0.6mm)。结果：1. DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒沉淀通过超声粉碎仪震荡溶解,基本完全溶解,外加磁场后DOX/rPAA@SPION迅速移向磁铁,溶液变得清亮,说明DOX/rPAA@SPION顺磁性良好。2. DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒的疗效：治疗后第4天,对照组肿瘤体积为137.47±20.62mm3,阿霉素组肿瘤体积为122.79±21.19mm3, DOX/rPAA@SPION磁性纳米组肿瘤体积为51.70±7.92mm3; DOX/rPAA@SPION组肿瘤体积不但显著小于对照组(p=0.000),也显著小于阿霉素组(p=0.000),阿霉素组与对照组相比肿瘤大小无显著差异(p=0.138)。治疗后8天,对照组小鼠肿瘤体积为259.88±7.70mm3,阿霉素组肿瘤体积为195.48±9.77mm3, DOX/rPAA@SPION组肿瘤体积为72.08±6.06mm3,阿霉素组及DOX/rPAA@SPION组肿瘤体积明显小于对照组肿瘤体积DOX/rPAA@SPION组肿瘤体积小于阿霉素组,且有统计学意义(p<0.05)。治疗后24天,对照组肿瘤体积为1378.29±104.85mm3,阿霉素组肿瘤体积为838.02±189.45mm3, DOX/rPAA@SPION组肿瘤体积为247.31±60.14mm3, DOX/rPAA@SPION组肿瘤体积小于对照组及阿霉素组,且有统计学意义(p<0.05)。治疗24天后,阿霉素的肿瘤抑制率为41.67%, DOX/rPAA@SPION的肿瘤抑制率为76.96%,明显高于阿霉素。3. DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒毒副反应：对照组裸鼠治疗当天体重为19.36±0.35(g),阿霉素组体重为19.39±0.37(g),DOX/rPAA@SPION组体重为19.37±0.35(g),治疗期间及治疗后,3组体重均无明显减轻,组间无统计学意义(p>0.05)。此外,3组裸鼠精神状态及活动能力一直良好,未见明显活动异常。HE染色结果显示3组肿瘤组织均见不同程度的坏死。与空白对照组一样,阿霉素组和DOX/rPAA@SPION组裸鼠的心脏、肝脏、肾脏均未见明显的炎症细胞浸润、组织坏死及纤维化等病理变化。4.DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒在治疗后24天在裸鼠体内的生物分布：普鲁士蓝染色是针对铁离子的检测方法,相比空白对照组及阿霉素组,DOX/rPAA@SPION组的肿瘤、心脏、肝脏、肾脏未见明显的铁沉积。5.DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒24小时内MRI显像结果：注射DOX/rPAA@SPION前,裸鼠肿瘤病灶的T2加权像信号相对较高,肺及肝信号正常；注射磁性纳米颗粒后12h,裸鼠肿瘤病灶信号变低,肺及肝脏信号也明显降低；注射磁性纳米颗粒后24h,裸鼠肿瘤病灶、肺及肝脏信号较注射前低、较注射后12h略高。结论：1.DOX/rPAA@SPION纳米颗粒对MDA-MB231乳腺癌动物模型的肿瘤生长具有明显抑制作用,抑瘤效果好于阿霉素。2.DOX/rPAA@SPION纳米颗粒治疗期间及治疗后,裸鼠精神状态良好且各脏器无明显病理学变化,提示其毒副反应低,生物安全性良好。3.DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒治疗后24天,肿瘤组织及各脏器未见铁沉积,提示其代谢快,生物相容性好。4.MRI可以显像示踪DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒,实现肿瘤病灶纳米颗粒的可视化及实时监测。注射后24小时肿瘤区仍见聚集,说明该磁性纳米颗粒半衰期长,药物作用持久。综上所述,DOX/rPAA@SPION磁性纳米颗粒是集载药、靶向及MRI显像于一体的多功能颗粒,用其治疗乳腺癌,在动物水平疗效好,且具有毒副反应轻、可以MRI显像的特点,可能具有较好的临床应用前景。