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短体线虫（Pratylenchus spp.）又称根腐线虫,属于迁移性内寄生线虫,分布于世界各地且寄主范围广泛。短体线虫与根结线虫和孢囊线虫是作物上危害最为严重的三种植物寄生线虫。由于短体线虫个体小和寄生的隐蔽性,其危害经常被忽视。咖啡短体线虫（P.coffeae）作为危害最为严重的短体线虫之一,在我国严重危害多种粮食作物和经济作物。咖啡短体线虫引起的作物根腐线虫病已成为我国农业生产上的重要病害,严重威胁我国农业生产安全,由于其定殖和适应能力强,该线虫的防治仍缺少有效的靶标和方法。目前,对咖啡短体线虫效应蛋白的研究十分匮乏,而分离鉴定该线虫食道腺表达的效应蛋白和明确这些效应蛋白的功能是了解咖啡短体线虫侵染致病的分子机制及其与寄主互作的关键。本论文通过形态学和分子生物学相结合的方法,对分离到的线虫进行分离鉴定,获得了3种短体线虫和1种螺旋线虫。纯化培养了咖啡短体线虫强致病力种群SY-1,获得了该线虫的组织蛋白酶Z和D基因（Pc-CZ和Pc-CD）的全长序列。本研究拟通过多种分子技术探究Pc-CZ和Pc-CD在咖啡短体线虫中的表达特性;利用RNAi和瞬时表达等方法验证该效应蛋白在咖啡短体线虫侵染致病过程中的功能及其对寄主防御反应的影响;通过酵母双杂交初步筛选出Pc-CZ在玉米文库中的互作蛋白。主要获得以下结果:1、线虫的分离鉴定本研究利用贝曼漏斗法对各地市采集样品中的短体线虫进行了分离,并通过形态学和分子生物学相结合的方法进行了种类鉴定。鉴定结果得到9个线虫种群中包括咖啡短体线虫2个种群、斯克里布纳短体线虫5个种群、落选短体线虫1个种群和小叶螺旋线虫1个种群,其中咖啡短体线虫A-21种群是中国芝麻上的首次报道,斯克里布纳短体线虫SC-1种群和HN-1种群分别是四川省番茄和海南省玉米上的首次报道,落选短体线虫SY-X种群是河南省玉米上的首次报道,小叶螺旋线虫LQ-1种群是河南省的新纪录种。另外,这9个种群均能在胡萝卜愈伤组织上扩繁培养。2、咖啡短体线虫效应蛋白基因Pc-CZ和Pc-CD的克隆与序列分析利用RACE技术获得了Pc-CZ和Pc-CD基因的cDNA全长序列。Pc-CZ基因全长1619 bp,ORF为1461 bp,编码486 aa,N端存在在一个26 aa的信号肽,蛋白质理论分子量（MW）为51.2 k Da,等电位点pI为7.46。Pc-CD全长1698 bp,ORF为1446bp,编码481 aa,N端存在24 aa的信号肽,蛋白质理论分子量（MW）为53.2 kDa,等电位点pI为5.52。3、咖啡短体线虫效应蛋白基因Pc-CZ和Pc-CD的表达特性及组织定位利用qRT-PCR检测了Pc-CZ和Pc-CD基因在咖啡短体线虫4种不同虫态（雌虫、雄虫、幼虫和卵）的表达水平,结果显示Pc-CZ和Pc-CD基因在咖啡短体线虫的4种虫态中均有表达,且都在雌虫中的表达量最高,Pc-CZ在雄虫的表达量相对最低,Pc-CD在卵中的表达量相对最低。利用原位杂交技术明确了Pc-CZ和Pc-CD均在咖啡短体线虫的食道腺特异表达。4、咖啡短体线虫效应蛋白Pc-CZ和Pc-CD的亚细胞定位及Western blot检测利用农杆菌介导法在烟草叶片上瞬时表达咖啡短体线虫Pc-CZ和Pc-CD,分析其重组蛋白在植物细胞的定位情况。共聚焦显微镜观察结果显示,Pc-CZ和Pc-CD定位在烟草叶片的细胞膜和细胞核。Western blot结果表明,融合蛋白PEG104-Pc-CZ和PEG104-Pc-CD均能在本氏烟的叶片细胞中正常表达。5、效应蛋白基因Pc-CZ和Pc-CD在咖啡短体线虫侵染致病及生殖过程中的功能利用in vitro RNAi方法,证实了咖啡短体线虫效应蛋白基因Pc-CZ和Pc-CD经dsRNA浸泡处理后,在一定时间范围内,靶基因的沉默效率随着浸泡时间的延长而增加。Pc-CZ在RNAi沉默24 h时,表达量与对照组相比下降了78%,此时沉默效率最佳;Pc-CD在RNAi处理12 h时沉默效率最高,与对照组相比表达量下降了81.4%。Pc-CZ基因RNAi处理24 h后,咖啡短体线虫在胡萝卜愈伤组织上的繁殖力与对照组相比下降了72.5%,该处理组线虫对番茄的致病力也显著降低。Pc-CD基因RNAi处理12 h后,咖啡短体线虫的在胡萝卜愈伤组织上的繁殖力与对照组相比下降了66.5%,该线虫对番茄的致病力也显著降低。将不同浸泡处理的咖啡短体线虫分别接种长势一致的番茄幼苗根系48 h后,酸性品红染色结果显示,Pc-CZ和Pc-CD RNAi 24 h和12 h处理组番茄根系中线虫的数量显著低于对照组,说明RNAi处理能显著降低咖啡短体线虫对番茄的侵染力。以上试验结果表明:效应蛋白基因Pc-CZ和Pc-CD在咖啡短体线虫侵染致病和繁殖过程中发挥重要作用。6、效应蛋白Pc-CD和Pc-CZ对寄主防卫反应的影响利用农杆菌介导法在烟草叶片中瞬时表达咖啡短体线虫Pc-CZ和Pc-CD蛋白,分析重组蛋白对植物防卫反应的影响结果显示:在烟草叶片上瞬时表达Pc-CZ和Pc-NS-CZ均能显著抑制寄主PTI相关基因Acre3,Grans2和Pti5的表达,烟草水杨酸和茉莉酸通路的PAL和LOX基因的转录水平与对照组相比也显著下调。在烟草叶片中瞬时表达Pc-CD和Pc-NS-CD均能显著抑制水杨酸和茉莉酸通路的LOX和PR1基因的转录水平,瞬时表达Pc-CD抑制寄主PTI相关基因Acre3,Grans2和Pti5表达不明显,而瞬时表达Pc-NS-CD能显著抑制PTI相关基因Acre3和Grans2的表达。咖啡短体线虫的Pc-CZ和Pc-CD无论是否含有信号肽,均能够显著抑制flg22激发烟草ROS的爆发。此外,Pc-CZ和Pc-CD无论是否含有信号肽均能够特异的抑制Gpa2/RBP-1蛋白诱导的烟草叶片的细胞坏死。这也进一步证实,食道腺特异表达和分泌的效应蛋白Pc-CZ和Pc-CD均能够抑制寄主的ETI反应。7、酵母双杂交验证玉米文库中Pc-CZ的互作蛋白构建Pc-CZ诱饵载体,证实重组蛋白PGBKT7-Pc-CZ的表达对酵母细胞无毒性且无自激活活性。通过酵母双杂交文库筛选技术,初步证实玉米文库中有8个蛋白与咖啡短体线虫Pc-CZ蛋白互作。