癫痫是一种脑部神经元异常放电导致中枢神经系统（CNS）功能突然反复和短暂失常为特征的神经系统慢性疾病,是影响人类健康的一大类疾患,治愈率低,根治难。近年研究提示癫痫等病症的发生与神经胶质细胞的受损及功能异常也有着密切的关系,对于神经胶质细胞参与癫痫等疾病的发生以及其调控神经元功能的研究受到密切关注。神经胶质细胞是广泛分布于CNS内包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。它们具有支持、营养神经元的作用,也具有分泌和调节某些活性物质的功能。其中少突胶质细胞（oligodendrocyte,OLs）是CNS髓鞘形成细胞,对髓鞘的形成和信息的传递发挥着极为重要的作用。脊椎动物CNS中的髓鞘是由OLs胞浆向其附近神经轴突延伸并包绕形成的多片层膜性结构,具有加快神经传递速度、绝缘以及营养作用。CNS髓鞘的形成和完整性保证了神经信息的精确、高效传递,对中枢信息整合发挥着极其重要的作用,表明髓鞘形成是脑发育成熟和确保脑功能正常的重要标志之一。Lu等2000年对OLs发育分化的研究结果提示,转录因子Olig1、Olig2对脊髓OLs的定向分化具有不可替代的调控作用。新近有实验将过表达Olig2的神经干细胞移植入损伤脊髓,观察到脊髓中的包绕轴突的髓鞘厚度明显增加,提示转录因子Olig2加快OLs髓鞘的成熟过程,促进髓鞘的再生。同时,OLs的发育异常、脱髓鞘或髓鞘再生障碍与多种CNS疾病如多发性硬化、癫痫等的发生密切相关。有学者研究脱髓鞘模型鼠时观察到部分模型小鼠伴有癫痫的发作。近年对常染色体突变Shiverer（Shi）导致先天性脑髓鞘发育缺陷的小鼠研究发现,在生后第二周出现震颤,随后出现经常性惊厥。证实髓鞘的发育异常与脱失可造成癫痫等病症的发生。髓鞘异常是导致CNS无法正确编码并处理神经元活动信号的重要原因,故CNS内髓鞘发育不全或脱髓鞘也是癫痫的致病因素之一。然而,癫痫是否会引起脑内髓鞘发育的异常,目前仍然存在争议。因此,了解发育过程中,尤其是了解伴随自发性反复癫痫发作的大鼠脑内髓鞘的变化及其调控机制具有重要意义。众所周知,在生理条件下Ca²⁺作为第二信使可影响神经递质释放,并激活下游各种信号蛋白的表达。在病理状态下Ca²⁺稳态的失衡即Ca²⁺超载,被认为是导致细胞死亡的最关键的“共同通路”。既往研究已明确癫痫发作是脑部神经元过度高频重复放电,造成突触末梢兴奋性递质与抑制性递质释放平衡紊乱,导致细胞内Ca²⁺稳态失衡。细胞Ca²⁺稳态的维持是Ca²⁺的移入机制和移出机制动态平衡的结果。近年研究显示在少突胶质细胞前体细胞向OLs分化的过程中,在兴奋性氨基酸AMPA刺激后,细胞内Ca²⁺的升高与钠钙交换体蛋白(Na⁺/Ca²⁺ Exchangers,NCXs )移出Ca²⁺的能力下降密切相关。因此,NCXs对OLs内钙稳态的调节起重要作用。那么,癫痫发作脑内OLs中Ca²⁺的异常是否存在NCXs的功能减退,继而也影响OLs的分化成熟与髓鞘的发育?尚未见文献报道。为此,本文旨在明确急、慢性癫痫发作的大鼠脑内髓鞘发育变化情况,探讨癫痫与脱髓鞘病变是否存在因果关系;明确Ca²⁺通道相关蛋白NCX3的mRNA的时空表达变化,探讨脑白质区域内癫痫发作对Ca²⁺通道相关蛋白NCX3是否存在影响;明确髓鞘发育过程中转录因子Olig2的表达变化情况,探讨慢性癫痫大鼠脑内是否髓鞘变化与二者变化相关性。为寻找癫痫发作与脱髓鞘病变发生间是否存在直接因果关系提供实验证据;为寻找和开发有效的抗癫痫药物提供新的靶标,为神经变性疾病的发病机理提供新的实验依据。本实验分为三个部分:第一部分慢性反复性癫痫模型建立及鉴定采用出生3-4周龄幼鼠（n=40）,运用氯化锂-匹罗卡品联合腹腔注射,并用水合氯醛终止。对照组幼鼠（n=10）采用腹腔注射生理盐水。观察行为学判定癫痫发病阶段,并通过定期脑电图EEG检测筛选出符合SRS状态的大鼠,最后运用Nissl染色观察大鼠脑内神经元的变化。主要结果如下:1.行为学观察:急性期:氯化锂-匹罗卡品腹腔注射15分钟后,97.5%的幼鼠即可诱导出现全身强直、双前肢阵挛伴站立、摔倒,且反复发作。对照组幼鼠均未出现癫痫发作或死亡。慢性期:SE发作1周后至17周,可观察到面部咀嚼运动、点头运动或一侧前肢阵挛等状态;且呈不定期反复发作（ spontaneous recurrent seizures, SRS）。12周后采用强迫游泳检测观察到,模型组大鼠的静止时间为44.25s明显高于正常对照组大鼠18.67s（P<0.01）。2.脑电图EEG检测:正常对照组大鼠脑电图基本节律以α,β波为主,散在θ波。幼鼠SE发作12周后仍检测出频发尖波、棘-慢、尖-慢综合波典型痫性电波。3. Nissl染色结果:正常对照组大鼠脑内海马CA3区、CA1区及齿状回颗粒细胞层可见大量致密的锥体细胞及颗粒细胞,排列整齐,形态完整,胞浆内尼氏小体丰富清晰,神经元呈蓝色。模型组幼鼠SE发作后12周大鼠脑内海马CA3区、CA1区及齿状回颗粒细胞层内神经元排列松散、细胞轮廓模糊,着色不清晰,突起不明显。神经元数目明显减少,与正常组相比有显著差异（p<0.01）。结果表明:氯化锂-匹罗卡品可成功诱导幼鼠癫痫发作且达到SE状态。SE发作1周后行为学观察到SRS发作表现并持续至17周,脑电图检测及Nissl染色检测均提示符合慢性期癫痫的诊断标准。该方法建立的急性、慢性癫痫模型是适用于探讨癫痫形成及相关机制的理想模型。第二部分SRS大鼠脑内髓鞘的发育变化研究通过PCR技术、MBP免疫组织化学染色和髓鞘卢卡斯快蓝（LFB）染色技术检测癫痫发作后急性期（SE后6小时）和慢性期（17周）大鼠脑内胼胝体、海马和皮层区域中MBP mRNA和蛋白的表达变化。主要结果如下:1. PCR检测:比较各组胼胝体、海马和皮层MBP的PCR产物电泳图的光密度值。幼年对照组与急性期模型组相比均无差异;成年对照组与幼年对照组相比明显升高（P<0.05）;SRS组与成年对照组相比明显降低（P<0.05）。2. MBP免疫组化染色显示:SRS模型组在胼胝体、扣带回等白质区域和第一躯体感觉皮质S1BF、第一听皮质Au1等灰质区域内阳性着色变浅,区域明显减小。上述区域内平均光密度值（OD）与正常对照组相比相差显著（P<0.05）。3. LFB染色显示:SRS模型组大鼠胼胝体、扣带回和海马白质等白质区域内LFB着色均较浅,着色范围减小。阳性区域内平均光密度比值（OD）与正常对照组相比相差显著（P<0.05）。结果表明:成年大鼠脑内MBP mRNA和蛋白的表达高于幼年期,符合CNS的髓鞘发育学规律。幼鼠SE急性期髓鞘未见明显变化,而成年后仍伴有慢性SRS的大鼠脑内胼胝体、海马和皮层区域出现明显的髓鞘脱失,提示慢性癫痫的SRS可能影响OLs的发育与髓鞘成熟,是造成脱髓鞘病变的原因之一。第三部分SRS大鼠脑内脱髓鞘发生的相关机制研究通过PCR技术和原位杂交技术以及免疫组织化学染色检测癫痫发作后急性期和慢性期大鼠脑内胼胝体、海马和皮层区域中钠钙交换体NCX3 mRNA以及转录因子Olig2的时空表达变化。主要结果如下:1. PCR检测大鼠各组脑中胼胝体、海马和皮层中的NCX3 mRNA表达,结果显示:急性期模型组各区域NCX3的PCR产物电泳图的光密度值与幼年对照组相比明显增高（P<0.05）。SRS组与成年对照组相比,各区域则明显减少（P<0.05）。2. NCX3 mRNA原位杂交结果:正常对照组（幼年和成年）:整个大鼠脑中均可观察到NCX3 mRNA的阳性信号表达。急性期模型组与幼年对照组相比,在胼胝体、扣带回以及部分大脑灰质区域的表达明显增高（P<0.05）。SRS模型组在胼胝体、扣带回以及部分大脑灰质区域的表达均显著低于正常对照组（P<0.05）。3. Olig2免疫组织化学染色结果正常对照组（幼年和成年）:Olig2免疫阳性产物表达于细胞核内,阳性细胞分布于胼胝体、扣带回等白质区域;且幼年期阳性细胞数目明显高于成年期。急性期模型组与幼年正常对照组相比阳性细胞数目明显降低（P<0.05）。SRS模型组Olig2免疫阳性细胞染色浅淡、阳性细胞数目与成年正常对照组相比明显减少（P<0.05）。结果表明:（1）幼鼠癫痫SE急性期脑内胼胝体、扣带回以及部分大脑灰质区域NCX3 mRNA表达的增高,可能与癫痫SE发作早期NCX3的应激性反应有关,也可能对致痫药物作用的反应有关,出现短暂性清除钙能力增强。慢性癫痫SRS大鼠脑内上述区域NCX3 mRNA表达明显降低,提示白质区域中OLs的Ca²⁺的外排能力减弱,可导致OLs的慢性Ca²⁺稳态失衡,可能是引起OLs损伤、影响髓鞘的发育并造成髓鞘脱失的重要原因之一。（2）幼年期转录因子Olig2的表达明显高于成年期,提示Olig2在幼年期对OLs的发育和髓鞘的成熟至关重要。幼鼠癫痫SE急性期脑内白质区域Olig2的表达下降、且成年SRS中进一步表达减少,提示幼年期癫痫SE发作不仅干扰了Olig2的表达,可能会造成发育期的OLs成熟能力的减退,导致成年后髓鞘形成、髓鞘再生能力减退。