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目的:用4质粒表达系统构建来源于人类免疫缺陷病毒(Human Imunodeficiency Virus-1,HIV-1)的表达绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein,GFP)的慢病毒载体(lentiviral vectors,LV),标记大鼠脊髓神经干细胞并进行体内移植,观察神经干细胞在体内的迁移与存活。
方法:4质粒系统中,包装质粒含巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子和来自胰岛素基因的Poly(A)位点;包膜质粒编码水泡性口炎病毒-G糖蛋白(vesicular stomatitis virus-G glycoprotein,VSV-G);转移质粒含标志基因GFP;REV质粒含rev。用磷酸钙沉淀法将4质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞——293T细胞,36小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,收集病毒上清超速离心浓缩收集。将LV转染HeLa细胞检测其感染能力。用p24-ELISA(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定慢病毒载体的浓度。用表达GFP的慢病毒载体转染大鼠脊髓神经干细胞,以PLGA为支架移植入大鼠T9段半横断脊髓损伤处。移植后1个月在荧光显微镜下观察神经干细胞在脊髓内的迁移,并计算其存活率。
结果:转染293T细胞后在荧光显微镜下观察到很强的绿色荧光,表明成功构建了表达GFP的慢病毒载体的4质粒表达系统。慢病毒载体感染的HeLa细胞有很强的GFP表达。感染的大鼠脊髓神经干细胞球表达强烈的绿色荧光。神经干细胞移植于脊髓后1个月,在损伤脊髓的头端和尾端都可见GFP阳性细胞。计算出的存活率为:1.4911±0.0313%。
结论:成功构建了表达GFP的慢病毒载体的4质粒表达系统,其标记的神经干细胞移植入大鼠损伤脊髓后向脊髓组织内迁移并有少数存活。