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近年来随着肿瘤学治疗的进步,青春期前儿童肿瘤患者的治愈率达到了80%[1],然而不幸的是这些肿瘤治疗常常会使精原细胞丧失而造成永久性的不育[2-3]。因此青春期前儿童的生育力保存成为日渐紧迫的临床需求。对于精液中有精子的男性来说生育力保存最好的方法是冷冻精液[4] [5]。自从使用冷冻精液行人工受精获得首次成功后,至今深低温冷冻保存精子和精液已经成为一项发展非常完善的技术,常规应用于临床。但其不足之处在于只适用于成年男性,不适用于青春期前男孩,因为对于青春期前的男孩来说他们还不能产生精子。对于他们来说冷冻保存睾丸组织[6-7]或睾丸细胞悬液[8]可能是他们保存生育能力的最佳的选择。冷冻睾丸组织和睾丸细胞悬液各有利弊。如果睾丸组织中含有受损的细胞或者癌细胞,可能会影响生殖细胞的存活率或在移植的时候引入癌细胞,这时冷冻保存睾丸细胞悬液效果会更好[9]但是这会增加所需要的样本量,酶解处理可能会影响细胞的生存能力。操作过程可能会直接导致细胞连接的机械性损伤,加重细胞的缺氧,损伤细胞。冷冻睾丸组织可以避免这些负面影响[10]。青春期前男孩还没有进行完全的精子发生,把精原细胞以及毗邻的细胞作为一个整体组织来保存是必要的[11]。因为已经得到证实在睾丸组织中保存支持细胞以及细胞之间的连接对接下来的精原细胞成熟非常重要[12]。因此对于未成熟睾丸组织的冷冻保存研究显得更有意义。Jahnukainen[13]等认为对于移植后的存活来说在深低温保存睾丸组织中冷冻保护剂的类型是非常关键的,不同的冷冻保护剂在冷冻效果上有很大的差异,而冷冻保护剂的浓度对冷冻效果也有很大的影响。我们的实验在采用同一种非程序降温方式冷冻保存未成熟睾丸组织中使用了三种不同的冷冻保护剂,用光镜和投射电镜观察来对冷冻保存效果进行评估,以此探寻冷冻保存未成熟睾丸组织的最佳冷冻保护剂。方法:取出生后10天的昆明小鼠乳鼠,75%酒精消毒后脱颈处死,取两侧睾丸并在解剖镜下去除白膜和脂肪垫。将获得的睾丸组织随机分为新鲜对照组,甘油组,DMSO组和DMSO加蔗糖组。新鲜对照组不接受任何处理立即固定,其余三组分别装入含有1.5毫升相应冷冻保护剂的冻存管中。冻存管先在冰上平衡40分钟,接着放入-20℃冰箱保持60分钟,然后直接放入液氮中冷冻保存一个月, 37℃水浴复苏,用预冷的新鲜培养基漂洗,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,切片,用于光镜和免疫组化观察。电镜标本用2.5%戊二醛固定,饿酸后固定,树脂包埋,超薄切片,电镜观察。结果:1光镜:⑴HE染色:观察各组睾丸组织中的形态结构改变,DMSO加蔗糖组中结构未见受损,中心有深染损伤细胞和核固缩样细胞的生精小管(STs)百分比与新鲜对照组之间没有明显差异(P>0.05)。DMSO组与新鲜对照组和DMSO加蔗糖组相比未受损的曲细精管百分比有明显下降,而中心有深染损伤细胞和核固缩样细胞的生精小管百分比有明显升高(P<0.05)。甘油组与新鲜对照组,DMSO加蔗糖组和DMSO组未受损的曲细精管百分比有明显下降,中心有深染损伤细胞和核固缩样细胞的生精小管百分比要明显上升(P<0.05)。⑵免疫组化:形态未受损的精原细胞百分比在DMSO加蔗糖组为87.693±2.408%,新鲜对照组为91.971±3.209%,二者之间没有明显的差异(P>0.05)。DMSO组为71.707±3.512%,比新鲜对照组和DMSO加蔗糖组有明显的降低(P<0.05)。而甘油组为57.895±6.083%,又比DMSO组有明显降低(P<0.05)。从毗邻支持细胞上分离的精原细胞百分比以及变性的精原细胞百分比DMSO加蔗糖组(分别为10.769±3.049%,1.538±0.212%)与新鲜对照组(分别为7.299±4.690%,0.730±0.093%)没有明显差别(P>0.05)。DMSO组(分别为22.439±5.603%,5.854±2.307%)明显升高(P<0.05)。甘油组(分别为31.579±3.847%,10.526±2.143%)比DMSO组又有明显升高(P<0.05)。2电镜:在DMSO加蔗糖组中精原细胞所受到的影响较轻微,标本中大多为保存完好及在基膜上附着良好的细胞,与新鲜对照组细胞形态相似。在高倍下标本中还可看到空泡增加,但这些改变都是非常轻微的。在DMSO组中仍可观察到精原细胞在基膜上附着良好,但胞质中的空泡明显增加,细胞核开始出现凝集现象。甘油组标本可观察到精原细胞从基膜上剥离,细胞核凝集,固缩,胞质中空泡明显增多变大,线粒体肿胀。结论:在冷冻保存未成熟睾丸组织中,作为冷冻保护剂,DMSO对精原细胞的冷冻保存效果要明显好于甘油,而DMSO加蔗糖对精原细胞的冷冻保存效果又明显好于单纯的DMSO。说明渗透性保护剂与非渗透性保护剂联合应用是冷冻保存未成熟睾丸组织的最佳冷冻保护剂。