冠心病是危害人类健康的严重疾病，心肌梗死更是“第一危险杀手”，尽早对缺血心肌再灌注是治疗心梗的根本措施，但是心肌缺血再灌注往往造成“二次损伤”，可导致缺血区心肌损伤进行性加重。所以如何减轻心肌缺血再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusion injury，MI/RI）已成为医学工作者研究的热点，寻找一种安全、有效的药物更是迫在眉睫。人参是我国传统的中药，具有保护缺血心肌、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等诸多方面的作用。25-羟基-原人参三醇[25hydroxyl-Protopanaxatriol，25-OH-PPT，代号T19，下文以T19出现，化学名：20（R）-达玛烷-3β，6α，12β，20，25-五醇，分子式：C30H54O5，分子量：494]，是从人参茎叶中提取出的单体，属于原人参三醇类，是一种人参皂苷元。据文献报道，人参总皂苷及人参二醇组皂苷具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用，但关于25-羟基-原人参三醇对于心肌缺血再灌注损伤的影响尚未见报道。那么此种人参单体能否成为保护心肌缺血再灌注损伤的安全有效的药物呢？将是本课题研究的重点。本研究首先采用在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型，研究T19对大鼠MI/RI的保护作用及其机制；其次应用H2O2诱导的H9c2心肌细胞模型，研究T19对H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化应激性损伤的保护作用及其机制。第一部分25-羟基-原人参三醇预处理对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损伤的保护作用目的：观察25-羟基-原人参三醇预处理对Wistar大鼠心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤的保护作用及与药物剂量的相关性，观察PI3K抑制剂LY294002对心肌缺血再灌注损伤的影响。方法：（1）将实验动物Wistar大鼠，雌雄各半，体重180-250g，分为7组（每组20只）：假手术Sham组，I/R组，T19a组（I/R+T19低剂量），T19b组（I/R+T19中剂量），T19c组（I/R+T19高剂量），抑制剂组（I/R+T19高剂量+LY294002），阳性药曲匹地尔Trapidil组（I/R+Trapidil）。T19低、中、高剂量分别为5、10、20mg/kg/d，灌胃7d。抑制剂组：20mg/kg/d T19灌胃7d，末次灌胃前30min腹腔注射LY2940020.3mg/kg。Trapidil剂量为：15mg/kg/d，灌胃7d。（2）大鼠麻醉后，结扎大鼠左冠状动脉前降支制成心肌缺血模型，使心肌缺血30min，再灌注24h，制备缺血再灌注损伤模型，观察缺血再灌注24h的心电图、超声心动图，取心脏用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色法检测心梗面积，在光镜和电镜下观察心脏左室前壁的超微结构。用TUNEL法评估心肌细胞凋亡指数（AI）。检测再灌注24h心肌酶CK-MB、LDH和AST的含量。测量再灌注24h血清中SOD的活性，MDA的含量，CAT及GSH-Px的活性。结果：（1）缺血30min再灌注24h后，与I/R组比较，T19低剂量组心电图ST段比I/R组有下移，但无统计学意义（P>0.05），中、高剂量组与I/R组相比有明显下移（P<0.01，P<0.01），下移程度与T19剂量呈正相关。（2）与I/R组比较，T19低、中、高剂量组心肌梗死面积减少，低剂量组无统计学意义（P>0.05），中、高剂量组与I/R组相比有明显减少（P<0.05，P<0.05），减少程度与剂量呈正相关。（3）缺血前30min各组大鼠基线心脏超声测量结果无显著性差异。再灌注24h后，与I/R组比较T19低剂量组有增加左室射血分数（LVEF）和减少左室舒张末期容积（LVEDV）及左室收缩末期容积（LVESV）的趋势，但无显著差异（P>0.05）。T19中、高剂量组明显增加了LVEF值（P<0.01），降低了LVEDV和LVESV（中、高剂量组均为P <0.01），改变程度与T19剂量呈正相关。（4）再灌注24h后，与I/R组比较，T19低剂量组CK-MB、LDH、AST有减少趋势，但是无显著差异（P>0.05）；T19中、高剂量组可明显减少血清中CK-MB、LDH、AST值，有显著差异（P<0.05，P<0.05，P<0.05），且改变趋势与T19剂量呈正相关。（5）T19高剂量组明显增高了SOD、CAT、GSH-Px含量（P<0.05，P<0.05，P<0.01），降低了MDA含量（P<0.05），T19低、中剂量组对SOD、CAT、MDA没有明显改变（P>0.05），但两组可明显增高GSH-Px的含量（P<0.05，P<0.01）。（6）心肌病理学改变：在光镜、电镜下观察及用TUNEL检测：与I/R组相比，T19中、高剂量组能明显减少心肌坏死细胞，减少炎症细胞浸润，减少凋亡指数（P<0.01）。减少程度与剂量呈正相关。T19低剂量组则也有上述表现，但没有统计学差异（P>0.05）。与阳性药Trapidil组相比较，T19中剂量组对缺血再灌注损伤心肌的保护作用，与Trapidil组作用相当，而PI3K通路抑制剂LY294002组对心肌的保护作用均被阻断。结论：25-羟基-原人参三醇对大鼠实验性心肌缺血再灌注损伤有保护作用，低剂量无明显保护作用，中、高剂量组有明显保护作用，且作用效果与剂量高低呈正相关。PI3K/Akt通路参与了T19对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。第二部分25-羟基-原人参三醇通过PI3K/Akt信号通路介导对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损作用的机制研究目的：探讨PI3K/Akt信号通路在25-羟基-原人参三醇预处理对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损作用的机制。方法：（1）选用Wistar大鼠，雌雄各半，体重180-250g，随机分为5组（每组10只）：假手术Sham组，I/R组，T19组（I/R+T19），抑制剂组（I/R+T19+LY294002），Trapidil组（I/R+Trapidil）。T19组剂量为20mg/kg/d，灌胃7d，抑制剂组：20mg/kg/d的T19灌胃7d，末次灌胃前30min腹腔注射LY2940020.3mg/kg。Trapidil组剂量为15mg/kg/d，灌胃7d。结扎大鼠左冠状动脉前降支制成心肌缺血模型，使心肌缺血30min，再灌注24h后留取心脏和血清。（2）用Western blot法及免疫组化法检测各组心肌组织中Akt、p-Akt(Ser-473)、eNOS、p-eNOS（Ser-1177）、Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达。用硝化还原法检测各组血清中NO的含量。结果：（1）Western blot法及免疫组化法检测发现：各组心肌细胞中Akt和eNOS蛋白含量相当，没有显著差别（P>0.05）。T19组与I/R组比较明显上调磷酸化Akt及磷酸化eNOS蛋白含量（P<0.01），给予LY2940002后与T19组比较，明显下调磷酸化Akt及磷酸化eNOS蛋白含量（P<0.01）。（2）硝化还原法检测发现：T19组比I/R组NO含量明显增加（P<0.01），给予LY294002后，NO含量比T19组明显减少（P<0.01）。（3）Western blot法及免疫组化法检测发现：与Sham组比较，I/R组心肌组织中Caspase-3表达明显上调（P<0.01），Bcl-2表达明显下调（P<0.01），Bax表达明显上调（P<0.01）。与I/R组比较，T19组明显上调Bcl-2表达（P<0.01），明显下调Bax和Caspase-3表达（P<0.01，P<0.01）。抑制剂LY294002组则与I/R组相当，比T19组明显上调Bax和Caspase-3的表达（P<0.01，P<0.01），明显下调Bcl-2的表达（P<0.01）。Trapidil组比I/R组明显上调磷酸化Akt及磷酸化eNOS蛋白含量（P<0.01），明显增加NO含量（P<0.05），明显上调Bcl-2表达（P<0.01），明显下调Bax和Caspase-3表达（P<0.01，P<0.01）。结论：（1）25-羟基-原人参三醇减少大鼠心肌缺血再灌注的损伤可能与磷酸化Akt、磷酸化eNOS及NO有关。（2）25-羟基-原人参三醇抗心肌细胞凋亡可能是通过上调Bcl-2、下调Bax和Caspase-3蛋白表达实现的。（3）PI3K/Akt信号通路在缺血再灌注损伤后心肌保护中起了重要作用。其机制可能与PI3K/Akt通路介导凋亡蛋白的表达有关。（4）25-羟基-原人参三醇通过激活PI3K/Akt信号通路，保护心脏细胞内皮功能，减少凋亡，减轻心肌缺血再灌注损伤。第三部分25-羟基-原人参三醇对H2O2诱导的H9c2心肌细胞的保护作用及机制的研究目的：探讨25-羟基-原人参三醇对H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤模型的保护作用及机制。方法：（1）将H9c2心肌细胞分为七组：Control组、H2O2组、H2O2+T19低、中、高剂量组，H2O2+T19大剂量+LY294002组，阳性药Trapidil组。T19低、中、高剂量为31.25、62.5、125μg/ml，T19剂量预处理H9c2心肌细胞4h，然后即加入250μM H2O2作用6h；H2O2+T19高剂量+LY294002组的给药方法为先用25μM LY294002处理H9c2心肌细胞1h,之后再加入125μg/ml人参皂甙单体T19作用4h，最后加入250μM H2O2作用6h；阳性药Trapidil组剂量为30μg/ml。（2）用MTT法检测细胞活力，在显微镜下观察细胞形态，用Annexin-FITC/PI流式细胞仪荧光双染及Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡，评价T19对心肌细胞H2O2损伤是否具有保护作用及PI3K/Akt通路的参与作用。（3）再将H9c2心肌细胞分为五组：Control组，H2O2组，H2O2+T19组，H2O2+T19高剂量+LY294002组，阳性药Trapidil组。T19组剂量为125μg/ml，给药方法同前。（4）用Western blot法测上述五组Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达。结果：（1）用不同浓度的T19预处理H9c2心肌细胞，可减少H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤，减少细胞凋亡，并在一定范围内与T19剂量成正比。加入PI3K/Akt抑制剂LY294002后阻断了T19的保护作用。Trapidil组结果与T19高剂量组相当。（2）T19组比H2O2组明显上调磷酸化Akt及磷酸化eNOS表达(P<0.01)，LY组比T19组明显下调磷酸化Akt及磷酸化eNOS的蛋白表达(P<0.01)，T19组比H2O2组明显上调Bcl-2表达(P<0.01)，明显下调Bax和Caspase-3表达(P<0.01, P<0.01)，LY组比T19组明显下调Bcl-2表达(P<0.01)，上调Bax和Caspase-3表达(P<0.01, P<0.01)。Trapidil组表达与T19组相当。结论：25-羟基-原人参三醇对H2O2诱导H9c2心肌细胞损伤模型有保护作用。其机制可能与激活PI3K/Akt通路来调节凋亡相关蛋白，进而减轻H9c2细胞凋亡有关。