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【研究背景与目的】槟榔碱（Arecoline）是槟榔中最主要的生物碱,能诱导神经细胞毒性。硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）是近年来已被证明的一种内源性气体性神经保护因子,本课题小组已经发现H2S对槟榔碱诱导的神经细胞毒性具有保护作用。然而,H2S的抗槟榔碱所致的神经细胞毒性的具体作用机制仍不清楚。大量研究发现自噬流参与了神经保护作用。因此,本实验拟探讨自噬流是否参与H2S对槟榔碱诱导的神经毒性的拮抗作用,以深入阐释H2S抗槟榔碱神经毒性的作用机制。【方法】乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测PC12细胞LDH的释放率;Annexin V/propidium iodide（PI）染色流式细胞术检测PC12细胞的凋亡率;Hoechst 33258染色法检测凋亡细胞的形态;JC-1染色法检测PC12细胞的线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potentia,MMP）。透射电镜观察PC12细胞的自噬结构。Western blot检测PC12细胞的LC3I和LC3II蛋白（微管结合蛋白1A和1B的第三条轻链-I&II,Microtubule-associated protein1A/1B-light chain 3-I&II）和p62蛋白以及内质网应激的分子标记蛋白即葡萄糖调节蛋白（Glucose-regulated protein 78,GRP78）和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,Cleaved caspase-12）的表达。【结果】槟榔碱（0.5、1和2mM）处理PC12细胞24 h能明显增加细胞自噬泡的数量、增大LC3II/LC3I的比值以及增加p62蛋白的表达水平,表明槟榔碱可对PC12细胞的自噬流产生阻断作用。10μM的自噬流的抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）预处理30 min并没有加重槟榔碱（1 mM,24 h）对PC12细胞自噬流的阻断作用。200μM和400μM的NaHS（H2S供体）处理PC12细胞24 h后,PC12细胞的自噬泡数量减少、LC3II/LC3I的比值和p62蛋白的表达水平显著降低,表明H2S可促进PC12细胞自噬流。预处理NaHS（200μM和400μM）可逆转槟榔碱诱导的自噬泡数量的增加、LC3II/LC3I的比值的增大以及p62蛋白表达的上调,表明H2S可改善槟榔碱对PC12细胞自噬流的阻断作用。10μM的CQ预处理30 min可明显减轻NaHS对槟榔碱诱导的PC12细胞自噬泡数量的增加、LC3II/LC3I的比值的增大以及p62蛋白表达的上调的逆转作用,表明抑制自噬流可拮抗H2S对槟榔碱诱导的PC12细胞自噬流阻断的改善作用。CQ（10μM,30 min）预处理可以减轻NaHS对槟榔碱诱导的PC12细胞LDH释放量增加的抑制作用,表明抑制自噬流可取消H2S对槟榔碱所致的PC12细胞毒性的保护作用;CQ（10μM,30 min）预处理还可以减轻NaHS对槟榔碱诱导的PC12细胞凋亡率的增加、凋亡形态的发生和MMP的降低的逆转作用,表明抑制自噬流可减弱H2S的抗槟榔碱诱导的PC12细胞凋亡;CQ（10μM）预处理30 min也可显著取消NaHS对槟榔碱诱导的PC12细胞GRP78和Cleaved caspase-12蛋白上调的抑制作用,表明抑制自噬流可减轻H2S对槟榔碱诱导的PC12细胞内质网应激的拮抗作用。【结论】H2S可改善槟榔碱对PC12细胞自噬流的阻断作用,这种改善作用参与了其对槟榔碱神经毒性的拮抗作用。