论文部分内容阅读
MicroRNAs（miRNAs）属于一类内源性的非编码RNA，其长度一般为18~25个核苷酸。第一个miRNA lin4由Dr.Victor R.Ambros于1993年在线虫中发现，并且经证明与线虫的发育有关。随着越来越多的miRNA被发现，其功能也逐渐被发掘，并且组成了一个庞大的小分子调控RNA家族。研究表明，超过60％的哺乳动物基因表达受到miRNA的调控，它们主要涉及基因转录后水平的调节，进而参与到各种各样的细胞生理及病理过程，例如细胞的增殖、凋亡和分化，以及癌症的发生等。NR4A1（又称Nur77、TR3、NGFIB）为NR4A孤儿核受体超家族的成员之一，它是一种“即早基因”，可被多种因素，如激素、生长因子、炎症因子等快速诱导表达，并且在细胞的增殖、凋亡、血管重塑、炎症反应、糖脂代谢和肿瘤的发生中发挥重要作用。NR4A1在肿瘤发生发展中的生物学作用较为复杂，它既可作为癌基因促进细胞增殖、抑制凋亡；又可作为抑癌基因表现出抑制细胞增殖、促进凋亡的作用。NR4A1这种对肿瘤细胞生存的双重调节作用主要与细胞类型、细胞微环境及NR4A1的亚细胞定位有关。研究证实NR4A1在结直肠癌组织中表达增加，并且可以促进结直肠癌细胞的增殖与迁移。我们利用在线生物数据库TargetScan对NR4A1的3’-UTR（563bp）进行分析，结果发现在NR4A13’-UTR第52-58bp上存在miR-506的作用位点。并且miR-506在人类、黑猩猩、恒河猴等高级灵长类物种以及龋齿类动物中高度保守，都可以和相应物种NR4A1基因的3’-UTR互补配对。提示miR-506对NR4A1可能具有调节作用，进而参与了NR4A1对结直肠癌发生发展的调控过程。因此，本研究旨在探讨在结直肠癌中，miR-506对NR4A1的表达调控及其生物学意义，以期为结直肠癌提供新的治疗靶点。 我们首先运用qRT-PCR和Western Blotting检测结直肠癌组织和结直肠癌细胞中miR-506和NR4A1的表达水平，发现miR-506在结直肠癌组织和细胞中表达降低，NR4A1的mRNA和蛋白表达水平升高。利用Spearman相关分析方法，显示结直肠癌组织中NR4A1的mRNA表达与miR-506的水平呈明显负相关。细胞实验中我们发现miR-506mimic可以明显降低NR4A1 mRNA和蛋白表达水平，miR-506 inhibitor对NR4A1 mRNA的水平没有影响，但可以显著增加NR4A1的蛋白表达。3’-UTR双荧光素酶报告基因实验结果表明，miR-506 mimic可以降低野生型NR4A13’-UTR的活性，而对miR-506作用位点发生突变的3’-UTR活性没有影响，提示miR-506是通过直接靶向NR4A1的3’-UTR而下调NR4A1的表达。为了进一步阐明miR-506以及NR4A1在结直肠癌中的生物学功能，我们最后分别采用MTT、流式细胞术及transwell迁移和侵袭实验来检测miR-506和NR4A1对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果发现过表达miR-506或降低NR4A1的表达，均可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而在细胞中过表达NR4A1可以显著逆转miR-506对增殖、迁移和侵袭的抑制作用。 结论：我们的研究发现，miR-506通过直接靶向NR4A13’-UTR降低NR4A1的表达，进而作为肿瘤抑制因子抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。