作为严格细胞内寄生的微生物,病毒完全利用宿主细胞的生命维持系统来实现自身的复制增殖。因此,病毒与宿主细胞相互斗争决定了病毒的感染与致病。病毒感染宿主细胞后,半胱氨酸天门冬氨酸酶(caspases)启动细胞程序化死亡(即凋亡),以干扰病毒的复制,甚至清除病毒。与之相对的是,多种病毒蛋白冒充caspases的底物,利用其水解功能,产生有利于病毒复制的截断蛋白。例如,caspase-3、-6和-7共同切割丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A产生的截断蛋白通过改善感染细胞内环境以促进病毒复制。与HCV同属黄病毒科的猪瘟病毒(CSFV),其在复制过程中是否同样需要NS5A截断蛋白目前尚不清楚,为此,本研究对猪瘟病毒NS5A的切割及相关的分子机制进行了研究。为验证猪瘟病毒NS5A是否发生切割,猪瘟病毒强毒石门株(Shimen)和猪瘟兔化弱毒C株(C-strain)感染ST细胞,western blotting检测发现Shimen NS5A除了大小约为56k Da的完整蛋白外,还有一个大约40k Da截断蛋白,而C-strain NS5A仅有约56k Da的完整蛋白。因CSFV感染时NS5A表达量非常低,Shimen和C-strain NS5A的某些截断蛋白可能检测不到。为进一步验证猪瘟病毒株NS5A的切割,构建了Shimen和C-strain的NS5A-EGFP过表达细胞系,结果显示Shimen NS5A除了大小约83k Da的完整蛋白外,还有约68k Da的截断蛋白b,而C-strain NS5A则能产生约68k Da的截断蛋白b以及约63k Da的截断蛋白c。为验证参与HCV NS5A切割的caspases和calpains家族成员是否参与CSFV NS5A蛋白的切割,利用caspases和calpains家族蛋白酶活性抑制剂分别处理Shimen和C-strain NS5A过表达细胞系(P-E-S和P-E-H),结果显示caspases家族蛋白酶抑制剂仅能阻断C-strain NS5A截断蛋白c的产生,而calpains家族成员则不参与Shimen和C-strain NS5A的切割。氨基酸序列比对发现Shimen和C-strain NS5A 272至275位氨基酸是caspases的结合基序(D272TTD275)。此外,C-strain NS5A 271位是caspase-6偏嗜切割的颉氨酸,而Shimen NS5A 271位是其非偏嗜切割的丙氨酸。我们推测caspase-6介导C-strain NS5A产生截断形式c,此外,利用caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK处理P-E-H,结果显示Z-VEID-FMK能阻断C-strain NS5A产生截断蛋白c。此外,利用干扰分子下调P-E-H细胞的caspase-6表达水平,western blotting检测发现,caspase-6下调表达抑制截断蛋白c的产生。为进一步探索caspase-6对C-strain增殖的影响,C-strain感染caspase-6上调或下调表达的稳定细胞系,病毒滴度测定结果显示caspase-6上调表达不影响C-strain复制,而下调表达则显著抑制C-strain复制。然而,下调caspase-6表达水平或抑制其活性不影响Shimen复制。Calpain I和calpain II虽未参与Shimen和C-strain NS5A截断蛋白的产生,但可保护Shimen和C-strain NS5A免受未知宿主蛋白的切割。为进一步探索calpain I和calpain II是否参与Shimen和C-strain的增殖,calpain I抑制剂ALLN和calpain II抑制剂ALLM分别处理Shimen和C-strain感染的ST细胞,结果显示ALLN和ALLM浓度越高,对Shimen和C-strain复制的抑制越显著,表明calpain I和calpain II参与Shimen和C-strain的复制。为鉴定C-strain NS5A蛋白的caspase-6切割位点,将C-strain NS5A 271位颉氨酸和277位丙氨酸分别突变为与Shimen相同的271位丙氨酸和277位苏氨酸,272和275位天门冬氨酸分别突变为谷氨酸,成功构建了C-strain NS5A 4个不同突变的稳定表达细胞系。Western blotting显示275位天门冬氨酸和277位丙氨酸是截断蛋白c产生的关键氨基酸,而271位颉氨酸和272位天门冬氨酸与截断蛋白c产生无关。此外,将Shimen NS5A 277位苏氨酸突变为C-strain NS5A 277位丙氨酸,产生截断蛋白c;GD53 NS5A 275位谷氨酸突变为天门冬氨酸产生截断蛋白c。因此,CSFV NS5A 275位天门冬氨酸、277位丙氨酸是caspase-6切割NS5A产生截断蛋白c的关键氨基酸位点。此外,为鉴定与C-strain和Shimen NS5A截断蛋白b产生相关的关键氨基酸位点,序列对比分析C-strain、Shimen和GD53 NS5A的差异氨基酸位点,结合截断蛋白b的大小,将C-strain和Shimen NS5A 371位颉氨酸和373位天门冬氨酸分别突变为与GD53相同的371位亮氨酸和373位谷氨酸,并构建了相应的稳定表达细胞系,western blotting显示C-strain和Shimen NS5A 371位颉氨酸和373位天门冬氨酸与截断蛋白b的产生无关。进一步将C-strain NS5A 275、373位天门冬氨酸,335位丙氨酸,362和371位颉氨酸分别突变为GD53 NS5A突变为275、373位谷氨酸,335为颉氨酸,362位异亮氨酸和371位亮氨酸,构建同时突变上述2、3或4个氨基酸的C-strain NS5A稳定表达细胞系,结果显示上述突变位点都与C-strain NS5A截断蛋白b的产生无关。本研究首次对不同CSFV毒株非结构蛋白NS5A的切割进行了分析,研究发现caspase-6介导产生的C-strain NS5A截断蛋白c对病毒复制具有重要作用,同时也鉴定了C-strain NS5A的caspase-6切割位点。上述研究为进一步探索CSFV蛋白加工和病毒复制的分子机制奠定基础。