[目的] 近年来，禽流感在世界各地不断暴发，已经给禽养殖业造成巨大的损失。而且越来越多的患者也被确诊直接感染了禽流感病毒，提醒我们禽流感病毒已经严重威胁到人类的健康。研究表明，禽流感病毒的毒力与其NS1蛋白密切相关，对NS1蛋白功能的深入研究有助于了解禽流感病毒致病性增强的机制，为防止流感大流行提供依据。因此，本研究拟克隆、修饰禽流感病毒ns1基因并转染真核细胞，观察其对细胞干扰素-β(IFN-β)表达水平和细胞凋亡的影响。 [方法] 1.将A/Duck/Shantou/2088/01(H9N2)病毒株ns1基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-3，转化BL21(DE3)宿主菌，IPTG诱导表达融合蛋白GST-NS1。用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠，制备多克隆抗体。 2.运用DNAman软件对Genebank登录的H5N1亚型不同病毒株的ns1基因进行同源性分析，之后采用多重PCR方法对ns1基因进行修饰，引入缺失的15个核苷酸。 3.将H9N2和HSN1病毒株的ns1基因以及修饰后的ns1基因重组入真核荧光表达载体pIRES2-EGFP，脂质体转染293A细胞，RT-PCR及Western blotting检测ns1基因的表达。 4.转染后36h加入聚肌胞苷酸诱导7h，real time RT-PCR检测细胞中IFN-β表达水平。将重组真核表达载体转染A549细胞48h，荧光显微镜、Hochest 33342染色及DNA ladder观察细胞凋亡情况。 [结果] 1.在原核细胞中以可溶形式表达出H9亚型GST-NS1融合蛋白，表达量占细菌总蛋白15％～20％。制备的多克隆抗体可与NS1蛋白特异性结合，抗血清效价为1:51200。 2.对H5N1亚型分离株，ns1基因的分析显示，除了在238-252位存在15个核苷酸缺失外，ns1基因核苷酸序列的同源性大于90％。采用多重PCR方法成功引入了缺失的15个核苷酸。 3.得到重组真核载体pIRES2/ns1(2088)、pIRES2/ns1(852)和pIRES2/ns1(852+15bp)，转染293A细胞并表达NS1蛋白。 4.real time RT-PCR结果显示：三种NS1蛋白均能明显降低宿主细胞中IFN-β的表达水平，其中野生型H5亚型NS1蛋白抑制能力最强，H9亚型NS1蛋白最弱，修饰后NS1蛋白居中。 5.重组真核表达载体转染A549细胞48h后，荧光显微镜观察和DNA ladder分析均可见细胞凋亡发生，但三种NS1蛋白引起的凋亡无明显差别。 [结论] NS1蛋白功能与病毒株的毒力相关。H5N1亚型病毒株的NS1蛋白能更有效地抵抗宿主细胞中IFN-β的表达，有利于病毒在细胞中的复制和扩散。而且修饰后的NS1蛋白抵抗干扰素表达的能力低于野生型H5N1的NS1蛋白，提示近年来流行的野生型H5N1亚型禽流感病毒正通过改变NS1蛋白的功能来抵抗宿主细胞的干扰素水平，从而逃避宿主的抗病毒免疫反应，增强其致病性。该研究结果是对ns1基因缺失的15个核苷酸功能的首次报导。 H5N1和H9N2亚型病毒株的NS1蛋白均能诱导宿主细胞的凋亡，但不同病毒株之间未见明显差异，说明除流感病毒NS1蛋白外，还有其他因素(包括病毒和宿主两个方面)参与了诱导细胞凋亡的过程。诱导细胞凋亡与病毒毒力之间的关系还有待进一步研究。 [