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研究背景与目的肝纤维化可由病毒感染、酒精、胆管结扎和四氯化碳等引起,日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)感染导致的肝纤维化是日本血吸虫病的主要病理变化。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化是肝纤维化的中心环节。TLR4(Toll-like receptor 4)信号通路的活化在肝纤维化中发挥着重要作用,特别是肝星状细胞中TLR4信号通路的活化,但是TLR4通路信号与Sj感染所致肝纤维化的关系及其机制不明。我们已经报道了转谷氨酰胺酶2(transglutaminase2,TGM2)在Sj感染所致肝纤维化中起重要作用。因此,本研究的目的是鉴定在肝星状细胞内的TGM2和TLR4信号通路之间的调控关系、以及该调控在Sj感染所致肝纤维化的作用。研究方法1.日本血吸虫感染所致肝纤维化动物模型的建立:日本血吸虫尾蚴通过腹部皮肤贴片法对BALB/c小鼠(健康6-8周龄、SPF级、雌性)进行感染,于感染后的第0、5、6、8和12周收集标本。2.天狼星红染色法对日本血吸虫感染所致肝纤维化动物模型的鉴定:使用Abcam公司的天狼星红试剂盒及其说明书进行。3.对日本血吸虫感染小鼠使用TLR4信号通路阻断剂TAK242:在小鼠感染Sj后第4周开始使用,腹腔注射法,2次/周,0.3mg/kg体重/只鼠,连续注射4周。在感染后第8周收集标本。4.对日本血吸虫感染小鼠使用TGM2抑制剂胱胺:在小鼠感染Sj后第3天开始使用,连续7天,腹腔注射法,浓度10-2mmol/L,100μL/只小鼠,每天注射1次。在感染后第8周收集标本。5.动物标本的收集与处理:在相应时间点,收集各叶肝脏,分别进行总RNA提取、总蛋白和石蜡包埋等处理。6.肝星状细胞株的培养:肝星状细胞株购买于上海细胞所。用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行常规培养。7.RNA表达水平的半定量检测:Trizol法提取组织/细胞总RNA,继而用prime Script?RT Master Mix试剂盒按说明书逆转录成c DNA,利用SYBR Green II PCR Master kit对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Collagen I、Collagen III、转谷氨酰胺酶2(TGM2)、CD14、肿瘤坏死因子(TNF)-α、pro-IL-1β以及干扰素诱导蛋白(IP)-10、T细胞表达和分泌因子调节活化蛋白(RANTES)等的RNA表达水平进行半定量检测。8.蛋白表达水平检测:使用Western blotting法和免疫组织化学染色结合H-score半定量法。9.蛋白质表达的细胞定位:采用免疫荧光检测法结合激光共聚焦显微镜观察及后续的Image J软件分析法。研究结果:1.TLR4信号通路活化的关键分子的水平与日本血吸虫感染后5、6、8周的肝脏组织中胶原表达水平和α-SMA的表达水平一致;2.用TAK242抑制TLR4信号通路的活化,Sj感染8周肝脏组织的胶原表达水平和α–SMA水平随之下降;3.Sj感染的肝脏和体外培养的HSC株中都显示TLR4和α–SMA可共定位,并且该共定位的程度随着TAK242的使用而降低。4.对Sj感染肝脏和体外培养的HSC细胞株使用TAK242抑制脂多糖(LPS)刺激的TLR4信号通路活化,TGM2的水平随之降低。5.对Sj感染肝脏和体外培养的HSC细胞株使用胱胺抑制TGM2的活性,LPS刺激的TLR4信号通路活化可被抑制。6.对体外培养的HSC细胞株使用TGM2的激动剂全反式维甲酸或者重组TGM2蛋白的刺激,可上调TLR4信号通路同时伴有α-SMA和胶原的水平上调,该上调可随着CTM的使用而受到抑制。结论:1.TLR4通路活化通过促进肝星状细胞活化促进日本血吸虫感染引起的肝纤维化2.TGM2和TLR4信号通路之间的正反馈调控促进肝星状细胞活化继而肝纤维化