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银杏(Ginkgo biloba L.)是银杏科银杏属的孑遗植物,是我国重要的经济树种。类黄酮(flavonoids)是一类低分子量的多酚化合物,是银杏中重要的次生代谢产物,具有多种生物学功能。类黄酮的生物合成过程较为复杂,其受到内外多种因素的影响,随着对类黄酮研究的不断深入,发现MYB转录因子在类黄酮转录调控方面发挥着重要作用。目前,已在多个物种中鉴定到调控类黄酮合成的MYB转录因子,而银杏中的相关研究多局限于相关结构基因的克隆,而对于MYB转录因子的研究尚不完善。为此,本研究以银杏为实验材料,通过生物信息学手段初步筛选和鉴定出与类黄酮生物合成调控相关的MYB转录因子,进一步利用基因克隆、遗传转化和比较转录组学等方法对候选MYB的功能和分子调控机制开展了研究,其主要研究结果如下:(1)基于银杏全基因数据和实验室前期的转录组数据,利用生物信息学方法筛选出94个银杏MYB家族成员。根据氨基酸序列结构域的特点,将银杏MYB家族分为3大类,其中包括69个R2R3-MYB,22个1R-MYB和3个3R-MYB。将银杏与拟南芥的R2R3-MYB家族构建系统进化树,初步分析得到与拟南芥S4、S5、S6、S7亚族亲缘关系较近的MYB。进一步经过与其它物种中参与类黄酮调控的MYB构建进化树后,最终筛选出3个关键的候选MYB,分别命名为GbMYB4、GbMYB6和GbMYB11。(2)基因克隆分析表明,候选MYB的基因序列与基因组比对率均为100%,基因整体结构大致相同,均含有3个外显子,2个内含子。氨基酸序列中含有典型的R2R3重复序列,预测的蛋白质三级结构中具有螺旋-转角-螺旋的结构。烟草亚细胞定位实验显示GbMYB4、GbMYB6和GbMYB11均定位在细胞核上。(3)启动子顺式作用元件分析发现,GbMYB4启动子区域中存在低温、干旱、茉莉酸以及赤霉素响应元件;GbMYB6启动子区域中具有与防御以及胁迫相关的顺式元件;GbMYB11启动子区域具有低温、脱落酸、茉莉酸、生长素等响应元件,另外在3个基因的启动子区域中都发现存在一些光响应元件。这些结果表明,候选MYB可能受到激素和胁迫相关因子的调控。(4)构建了候选MYB基因的过表达载体,将其转入银杏愈伤组织后发现,GbMYB4转基因愈伤中总黄酮含量降低,GbMYB6和GbMYB11转基因愈伤中总黄酮含量升高。通过转录组测序,对类黄酮生物合成通路分析发现,在GbMYB4和GbMYB11过表达愈伤组织中,苯丙烷代谢途径的关键基因PAL、C4H、4CL和木质素合成基因CAD的表达显著上调;黄酮醇通路中FLS基因的表达均显著上调;参与异黄酮合成的HID基因上调表达,花青素和原花青素路径中DFR、ANS、LAR、ANR基因的表达与对照组相比呈下调趋势。这些结果表明GbMYB11的过量表达可能激活银杏类黄酮的合成代谢通路,进而调控促进类黄酮的积累,而GbMYB4可能通过抑制花青素合成相关基因的表达,使得类黄酮的含量降低。(5)对激素信号转导通路分析发现,在GbMYB4和GbMYB11过表达愈伤组织中,脱落酸信号通路中4个PYL基因和2个SnRK2基因表达呈上调趋势;茉莉酸的生物合成路径中的关键基因LOX、4CL8、ACX、MFP2、PKT表达基本上调,茉莉酸信号转导通路中茉莉酸氨基合成酶基因JAZ及MYC呈现出上调的趋势;乙烯和水杨酸信号转导通路中的基因表达显著上调。这些结果表明,GbMYB4和GbMYB11过量表达诱导了相关激素的信号转导通路,可能通过调控激素影响类黄酮的合成。(6)对转录因子分析发现,在GbMYB4和GbMYB11过表达愈伤组织中,AP2、WRKY、NAC和bZIP转录因子家族的多个成员差异表达,其中WRKY,NAC和bZIP中大多数基因上调表达。bHLH和WD40转录因子家族中,各有一部分成员的表达受到促进或者抑制,表明可能与MYB转录因子共同参与着类黄酮的调控。(7)将构建的35S::GbMYB4、35S::GbMYB6和35S::GbMYB11载体转化拟南芥植株。利用蘸花法通过农杆菌GV3101将过表达重组质粒转入拟南芥中,在培养基上进行抗性筛选,获得T2代转基因植株。通过提取各株系DNA,进行了 PCR阳性植株鉴定,共鉴定到12株阳性苗。通过测定拟南芥中类黄酮的含量发现,与对照相比,GbMYB6和GbMYB11转基因拟南芥中类黄酮含量升高,GbMYB4转基因拟南芥中类黄酮含量显著降低。结果表明GbMYB6和GbMYB 11转录因子正向调控类黄酮的合成,而GbMYB4转录因子抑制类黄酮的积累。